MicroRNA-218下調(diào)肝細(xì)胞癌中的E2F2基因表達(dá)抑制細(xì)胞增殖的研究

王濤　馬思聰　戚星星　湯曉寅　崔丹　王智　池嘉昌　李萍　翟博

200127　上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院腫瘤介入科

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·論著·

MicroRNA-218下調(diào)肝細(xì)胞癌中的E2F2基因表達(dá)抑制細(xì)胞增殖的研究

王濤馬思聰戚星星湯曉寅崔丹王智池嘉昌李萍翟博

200127上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院腫瘤介入科

【摘要】目的探討MicroRNA-218(miRNA-218)下調(diào)肝細(xì)胞癌中的E2F2基因表達(dá)，從而抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制。方法從細(xì)胞庫中取得人類肝癌細(xì)胞株HepG2、Huh7、MHCC-97H、BEL-7402和正常肝細(xì)胞株L02。隨后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)移、反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)、免疫印跡分析、細(xì)胞增殖和集落形成試驗、細(xì)胞周期分析和相應(yīng)的統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果miR-218表達(dá)水平在癌細(xì)胞中下調(diào)。MTT生長曲線表明,當(dāng)miR-218過度表達(dá)時(Huh7中的miR-218 P=0.001;在 MHCC-97中的miR-218 P=0.013)細(xì)胞增殖能力明顯降低。雙熒光素酶實驗證實，轉(zhuǎn)染了miRNA-218模擬物的細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，熒光酶報告基因含有E2F2野生型的第3′非翻譯區(qū)。這些結(jié)果表明E2F2是 miR-218的直接作用對象。與陰性對照組相比,轉(zhuǎn)染了miR-218 模擬物的Huh7和 MHCC-97細(xì)胞株中的E2F2的相對mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論miR-218通過直接作用于E2F2基因的第3′非翻譯區(qū)調(diào)節(jié)E2F2的表達(dá)，從而抑制HCC細(xì)胞增殖。

【關(guān)鍵詞】MicroRNA-218；肝細(xì)胞癌；E2F2基因；細(xì)胞增殖

MicroRNAs(miRNAs)可以有效調(diào)節(jié)各種生物過程,包括細(xì)胞增殖、遷移、分化和細(xì)胞凋亡。研究表明，miRNAs的調(diào)節(jié)異常與各種類型人類癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，而miR-218與腫瘤發(fā)病機(jī)制和各種類型癌癥的形成相關(guān)[1-2]。miR-218的表達(dá)下調(diào),可能作為細(xì)胞瘤、透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌和胃癌、鼻咽癌、宮頸癌、乳腺癌、口腔癌和小細(xì)胞肺癌的一種潛在的腫瘤抑制劑[3]。目前的研究都是基于假設(shè)與正常肝細(xì)胞相比，miR-218在肝癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),從而誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期檢查點，恢復(fù)miR-218可抑制細(xì)胞增殖[4]。本研究將在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析，旨在提供較為直接依據(jù)表明miR-218作用于E2F2來調(diào)節(jié)其在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)。

資料和方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)移

從中國科學(xué)院(上海)的細(xì)胞庫中取得人類肝癌細(xì)胞株HepG2 Huh7,MHCC.97H BEL.7402和正常肝細(xì)胞株L02。將這些細(xì)胞株培養(yǎng)在37 ℃、二氧化碳濃度低于5%、含10%胎牛血清(Gibco.BRL)的良伊格爾培養(yǎng)基(Gibco.BRL,Invitrogen Life Technologies,卡爾斯巴德、CA、美國)中。miR-218的模擬物和陰性對照(NC) 購自上海GenePharma有限公司。根據(jù)制造商的指導(dǎo)說明，利用Lipofectamine 2000(生命表達(dá)載體技術(shù))進(jìn)行miRNA的瞬時轉(zhuǎn)染分析。

二、反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)。

使用TRIzol試劑(英杰公司)從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取RNA。測量miR-218的表達(dá)水平使用TaqMan MicroRNA反轉(zhuǎn)錄工具包(pplied Biosystems, Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸。使用TaqMan微分析工具包(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)測量miR-218和內(nèi)源性控制的U6的表達(dá)水平。使用7500 實時PCR系統(tǒng)(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)、SYBR Premix Ex Taq(豆類生物技術(shù)有限公司)并以β-actin作為內(nèi)部控制進(jìn)行RT-qPCR實驗分析。引物由GeneCore生物技術(shù)有限公司(上海)設(shè)計并合成，序列如下:E2F2開頭,5′CGT CCC TGA GTT CCC AAC C3′和反向序列,5′GCG AAG TGT CAT ACC GAG TCT T3′; 和β-actin開頭,5′AGG CAC CAG GGC GTG AT3′和反向序列,5′TGC TCC CAG TTG GTG ACG AT3′。每個樣本一式3份。

三、免疫印跡分析

使用放射免疫沉淀法從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，并用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度。使用8% 的SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)，然后將其轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜中。加入5%脫脂奶阻滯后,細(xì)胞膜用兔抗人E2F2多克隆抗體(1∶200;sc-632;Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA)在4 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)整夜。隨后用吐溫20(TBST;Sigma-Aldrich)0.9%氯化鈉溶液(Affymetrix公司)沖洗,在室溫下，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二級山羊抗兔免疫球蛋白G抗體 (1∶1 000; Santa Cruz Biotechnology, Inc.)培養(yǎng)1 h。用TBST再次清洗，可用化學(xué)發(fā)光法檢測到蛋白帶。使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)捕捉數(shù)字圖像。β-actin被用作蛋白質(zhì)加載控制劑。蛋白質(zhì)片段的濃度使用Quantity One軟件4.5.0版本測量獲得。

四、細(xì)胞增殖和集落形成試驗

用MTT法檢測細(xì)胞增殖，然后分別將Huh7和MHCC-97H轉(zhuǎn)染NC-miR-218基因48 h,將細(xì)胞培養(yǎng)在96個孔中，每個孔中放入3000個細(xì)胞。然后將細(xì)胞分別培養(yǎng)12、24、36和48 h,在每個孔中加入20 μL MTT，37 ℃培養(yǎng)4 h,將細(xì)胞溶解在150 μL二甲亞砜中，490 nm測量吸光度評估細(xì)胞增殖。針對集落形成試驗,將400個細(xì)胞放置到6個培養(yǎng)井中，并在37 ℃培養(yǎng),直到細(xì)胞增長到可見的菌落。使用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗該菌落兩次,使用甲醇(Sigma-Aldrich)固定和用0.1%結(jié)晶紫(Sigma-Aldrich)標(biāo)記,然后統(tǒng)計每口井中的菌落數(shù)量。所有實驗執(zhí)行三次。

五、細(xì)胞周期分析

Huh7和 MHCC-97H細(xì)胞培養(yǎng)在60 cm的培養(yǎng)皿中，并分別用NC、miR-218放置一夜。PBS洗滌3次,在37 ℃的環(huán)境下，將這些細(xì)胞培養(yǎng)在100 μL核糖核酸酶(南京凱基生物技術(shù)有限公司)中30 min，并在400 μL 碘化丙啶(南京凱基生物技術(shù)有限公司)中額外浸染30 min。然后使用BD FACSCalibur細(xì)胞分析儀(BD生物科學(xué),富蘭克林湖,新澤西,美國)對樣品進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

六、雙熒光素酶實驗。

使用MicroRNA的目標(biāo)預(yù)測工具米蘭達(dá)(http://www.microrna.org)評估m(xù)iR-218的目標(biāo)基因。為了檢測E2F2是否為miR-218的直接下游靶基因，進(jìn)行了雙熒光素酶報告分析實驗。E2F2野生型(WT)的第3非翻譯區(qū)，包含miR-218的潛在結(jié)合位點和相應(yīng)E2F2的突變第3′非翻譯區(qū)被克隆到psiCheck2雙熒光素酶報告基因中。將Hug7細(xì)胞暫時轉(zhuǎn)染含有第3′非翻譯區(qū)的報告基因，使用Pikkagene雙熒光素酶報告實驗系統(tǒng)(TOYOB-Net有限公司,東京,日本)報告后轉(zhuǎn)錄miR-218模擬物及陰性對照48 h后的熒光素酶活性。

七、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。對兩組之間的差異性進(jìn)行分析,并在超過兩組以上分別使用t檢驗和單因素方差分析。所有統(tǒng)計分析進(jìn)行雙側(cè)檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、miR-218表達(dá)在人肝癌細(xì)胞株中下調(diào)

在進(jìn)行RT-qPCR實驗以確定miRNA在四個肝癌細(xì)胞系(Huh7、MHCC-97H、HepG2和BEL-7402)中的表達(dá),并與在人類正常肝細(xì)胞株(L02)的表達(dá)相對比。如圖1所示,miR-218在人類肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著下調(diào)。此外,與HepG2和BEL-7402細(xì)胞相比，Huh7和 MHCC-97H細(xì)胞中的miR-218表達(dá)水平更低。這些結(jié)果表明miR-218可用于抑制肝癌細(xì)胞。

二、miR-218抑制HCC細(xì)胞的增殖

如圖2所示,通過MTT法測量細(xì)胞活性。 MTT生長曲線表明,當(dāng)miR-218過度表達(dá)時(Huh7中的miR-218P=0.001;在 MHCC-97中的miR-218P=0.013)細(xì)胞增殖能力明顯降低。此外, 菌落集落形成試驗表明,轉(zhuǎn)染了miR-218模擬物的細(xì)胞菌落數(shù)量明顯低于未轉(zhuǎn)染者。

三、miR-218誘導(dǎo)細(xì)胞周期(G0/G1階段)停滯

流式細(xì)胞術(shù)分析表明,在G0/G1階段轉(zhuǎn)染了miR-218的 Huh7 和MHCC-97H細(xì)胞的百分比分別為16%(Huh7)和13%(MHCC-97H)，明顯高于陰性對照組,這與在S期細(xì)胞比例分別削減18%(Huh7)和23%(MHCC-97H)相一致。雙熒光素酶實驗證實，轉(zhuǎn)染了miR-218模擬物的細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，螢光素酶報告基因含有 E2F2基因的WT 第3′非翻譯區(qū)。這些結(jié)果表明E2F2是 miR-218的直接作用對象。與陰性對照組相比,轉(zhuǎn)染了miR-218 模擬物的Huh7和 MHCC-97細(xì)胞株中的E2F2相對mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。這與RT-qPCR的結(jié)果相一致,免疫印跡分析表明，轉(zhuǎn)染了miR-218的Huh7和MHCC-97細(xì)胞中的E2F2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖3。

A:miRNA-218在Huh7、MHCC-97H、HepG2、BEL-7402中的表達(dá);B:Huh7細(xì)胞中的miR-218表達(dá)水平C:MHCC-97H細(xì)胞中的miR-218表達(dá)水平；*P<0.05，**P<0.01

圖1miRNA-218在四個肝癌細(xì)胞系(Huh7、MHCC-97H、HepG2、BEL-7402)中的表達(dá)

A:Huh7和MHCC-97H細(xì)胞中的miR-218 在490 nm吸光值；B:Huh7和MHCC-97H細(xì)胞中的miR-218拷貝數(shù)

A:Huh7和MHCC-97H細(xì)胞中的E2F2基因表達(dá)水平；B:Huh7和MHCC-97H細(xì)胞中的E2F2基因表達(dá)水平(Western-blot)；C:Huh7和MHCC-97H細(xì)胞中的E2F2蛋白表達(dá)水平

圖3MicroRNA-218下調(diào)肝細(xì)胞癌中的E2F2基因表達(dá)

討論

普遍認(rèn)為miRNAs可以調(diào)節(jié)多種生物進(jìn)程,包括腫瘤。目前的研究表明了miR-218在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及如何在分子機(jī)制上發(fā)揮它們的功能[5,6]。本研究結(jié)果表明,miR-218表達(dá)水平在肝癌細(xì)胞中下調(diào),這與以前的研究結(jié)果一致[7]。本研究選取Huh7和MHCC-97H細(xì)胞，進(jìn)行MTT和集落形成試驗，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了miR-218模擬物的肝癌細(xì)胞與對照組相比，表現(xiàn)出較弱的增殖能力。此外,發(fā)現(xiàn)miR-218的過度表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G0 / G1期。因此推斷miR-218有腫瘤抑制功能。為了進(jìn)一步分析miR-218抑制肝癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，本研究進(jìn)行了基于生物信息學(xué)的預(yù)測和雙熒光素酶報告實驗,E2F2被確定為miR-218的直接作用對象。RT.qPCR和免疫印跡分析結(jié)果顯示，miR-218的上調(diào)可以下調(diào)E2F2的 mRNA和蛋白表達(dá)水平。這些結(jié)果表明，miR-218通過直接作用于E2F2基因的第3′非翻譯區(qū)調(diào)節(jié)E2F2的表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖。

作為主要的細(xì)胞周期調(diào)控劑，E2F蛋白質(zhì)在細(xì)胞周期信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下半游起作用，對細(xì)胞周期進(jìn)展中的細(xì)胞增殖及生長起至關(guān)重要的作用。E2F2作為 E2F的一種,激活E2F靶基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控G1 / S段相變。在正常的細(xì)胞周期控制中，細(xì)胞周期蛋白質(zhì)依賴激酶類(CDKs)的磷酸化作用是至關(guān)重要的,其導(dǎo)致Rb類蛋白質(zhì)的磷酸化[7-9]。Rb隨后激活E2Fs并允許G1 / S的相變[10,11]。有研究報道m(xù)iR-218抑制結(jié)腸癌中CDK4的表達(dá)。基于這些因素,可以假設(shè)miR-218調(diào)節(jié)E2F2的表達(dá);這種調(diào)節(jié)不僅通過直接針對E2F2起作用，還通過抑制CDK4的表達(dá),還需要進(jìn)一步的研究來驗證這個假設(shè)。

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(本文編輯：易玲)

Study on microRNA-218 inhibiting proliferation of hepatocellular carcinoma cell by down-regulating E2F2 gene expression

WANGTao,MASi-cong,QIXing-xing,TANGXiao-yin,CUIDan,WANGZhi,CHIJia-chang,LIPing,ZHAIBo.

DepartmentofInterventionalOncology,RenjiHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200127,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the mechanism for microRNA-218 (miR-218) dampening E2F2 gene expression to inhibit proliferation in hepatocellular carcinoma (HCC). MethodsHCC cell lines (HepG2, Huh7, MHCC.97H and BEL.7402) and normal hepatocyte cell line L02 were obtained from cell bank, which were subjected for reverse transcription-polymerase chain reaction, immunoblot analysis, cell proliferation and colony formation test, cell cycle analysis and relevant statistics analysis. ResultsThe miR-218 level was down-regulated in cancer cells (P<0.05). The growth curve of MTT indicated that proliferative capacity of cells was significantly reduced in miR-218-overexpressed cells (Huh7: P=0.001; MHCC.97: P=0.013). These results revealed that E2F2 was the direct target of miR-218. In comparison to control group of L02, the relative mRNA of E2F2 in Huh7 and MHCC.97 cell lines transfected with the stimulant of miR-218 was significantly down-regulated (P<0.05). ConclusionmiR-218 can directly act on the 3' untranslated region of E2F2 gene to inhibit the development of HCC.

【Key words】MicroRNA-218; Hepatocellular carcinoma; E2F2; Cell proliferation

(收稿日期：2015-10-15)

Corresponding author:ZHAI Bo, Email:zhaiboshi@sina.com

通信作者：翟博，Email：zhaiboshi@sina.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金(青年項目，81201678)；國家自然科學(xué)基金(面上項目，81472845)