插入失活法的應用

【摘 要】質粒是基因工程的常見載體，質粒的結構和重組質粒的篩選和鑒定是高考的熱點問題之一，本文通過分析質粒結構和插入失活法，結合2016年全國卷理綜第40題，探討重組質粒的篩選和鑒定問題。

【關鍵詞】質粒載體；標記基因；插入失活

質粒是基因工程的常用載體，質粒結構和功能也是高考熱點問題之一，2016年全國卷理綜第40題再一次以質粒圖譜為基礎，考查了質粒作為載體應具備的條件，重組質粒導入受體細胞的篩選與鑒定問題，而這一方面的知識在教材中講解較少，理解起來較抽象，難以透徹的掌握這個知識點，給解題帶來困難。本文特針對質粒結構及重組質粒篩選與鑒定問題進行補充，以期能對老師教學和學生解題帶來幫助。

載體是一種可將外源DNA片段送入宿主細胞進行擴增和表達的運載工具。目前已構建成的載體主要有質粒載體、噬菌體載體、病毒載體和人工染色體等多種類型。其中最常使用的是質粒載體。

一、質粒載體

質粒是一種獨立于細菌擬核DNA之外，具有自我復制能力的小型環狀DNA分子。由于天然質粒作為載體存在著不同的局限性，科研人員對其進行了修飾改造。作為高質量的克隆載體的質粒必須具有如下特征：1.有復制原點，這是質粒在宿主細胞內能自主復制的基本條件。2.有多種限制酶的單一識別位點，以供外源基因的插入。3.有標記基因，理想的質粒載體應具有兩種抗菌素抗性基因，以便從平板中直接篩選陽性重組子。4.相對分子質量較小。5.有安全性，作為克隆載體應當只存在有限范圍內的宿主；在體內不進行重組；不會發生轉移；不產生有害性狀；不會離開宿主而自由擴散，因而是相對安全的。

二、插入失活

將外源DNA片段插入到載體的標記基因中使此基因失活，喪失其原有的表性特征，稱為插入失活。pBR332是研究最多，應用最廣泛的質粒載體之一，該質粒有兩個標記基因， 四環素抗性基因（Tetr）和氨芐青霉素抗性基因（Ampr），有8種限制酶識別位點位于Tetr內部，另外有2種限制酶的識別位點是存在于該基因的啟動區內，在這10個限制位點上插入外源DNA都會導致Tetr的失活，這時含有DNA插入片段的pBR322將使宿主菌抗氨芐青霉素，但對四環素敏感。3種限制酶的識別位點位于Ampr內，在這些位點插入外源DNA則會導致Ampr的失活，這時含有DNA插入片段的pBR322將使宿主菌抗四環素，但對氨芐青霉素敏感。插入失活是檢測重組質粒的一種十分有效的方法。

三、實例應用

2016年全國卷理綜第40題是一道很好的考查質粒結構和插入失活效應的題目：

某一質粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導致相應的基因失活（Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環素抗性基因）。有人將此質粒載體用BamHI酶切后，與用BamHI酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉化大腸桿菌，結果大腸桿菌有的未被轉化，有的被轉化。被轉化的大腸桿菌有三種，分別是含有環狀目的基因、含有質粒載體、含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌。回答下列問題：

（1）質粒載體作為基因工程的工具，應具備的基本條件有______（答出兩點即可），而作為基因表達載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動子和終止子。

（2）如果用含有氨芐青霉素的培養基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉化的和僅含有環狀目的基因的細胞是不能區分的，其原因是______；并且______和_____的細胞也是不能區分的，其原因是______。在上述篩選的基礎上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌的單菌落，還需使用含有______的固體培養基。

（3）基因工程中，某些噬菌體經改造后可以作為載體，其DNA復制所需的原料來自______。

分析題目可知，本題考查了基因工程質粒載體特點、插入失活效應在重組質粒篩選中的應用及噬菌體侵染細菌后，合成子代噬菌體一切的原料來源于宿主細胞。分別解析如下：

（1）小題考查了質粒作為基因工程的載體應具備的基本條件，參考答案：具有復制原點；具有標記基因；具有限制酶的單一識別位點。

（2）小題考查插入失活及重組質粒的篩選問題，將此質粒載體用BamHI酶切后，與用BamHI酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉化大腸桿菌，得到的大腸桿菌表型有四種：未被轉化大腸桿菌，對四環素和氨芐青霉素都敏感，即AmpsTets表型；含有環裝的目的基因的大腸桿菌，即AmpsTets表型，含有質粒載體的大腸桿菌，即AmprTetr表型；含有插入了目的基因重組質粒的大腸桿菌，即AmprTets。若用含有氨芐青霉素的培養基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉化的大腸桿菌和僅含有環狀目的基因的細胞是不能區分的，其原因是都對氨芐青霉素敏感，都不能存活，都無菌落產生。含有質粒載體的大腸桿菌（AmprTetr）和含有插入了目的基因重組質粒的大腸桿菌（AmprTets）因都能抗氨芐青霉素，都能存活，產生菌落；但因為目的基因重組質粒因插入失活破壞了四環素抗性基因導致四環素抗性基因失活，因此可用含有四環素的固體培養基加以篩選。若是在含有氨芐青霉素的培養基上能形成菌落而在含四環素的固體培養基上不能形成菌落，就是我們所要的含有插入了目的基因重組質粒的大腸桿菌。

【參考文獻】

[1]陳閱增普通生物學/吳相鈺主編.—2版.—北京：高等教育出版社，2005.1

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