飲用水有機提取物對L02細胞增殖及細胞周期的影響*

岑延利， 楊光紅*， 桂曉玲， 張愛華， 李傳美

(貴州醫科大學 公共衛生學院， 貴州 貴陽　550025)

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飲用水有機提取物對L02細胞增殖及細胞周期的影響*

岑延利**， 楊光紅***， 桂曉玲， 張愛華， 李傳美

(貴州醫科大學 公共衛生學院， 貴州 貴陽550025)

[摘要]目的： 探討飲用水有機提取物對人正常肝細胞(L02)的細胞增殖及細胞周期的影響。方法： 體外培養L02細胞，將其分別暴露于培養液(空白對照組)、0.1% DMSO(溶劑對照組)和0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0 L/mL固相萃取法提取的飲用水有機提取物(染毒組)中24、48及72 h, 采用MTT法觀察L02細胞的增殖情況, 流式細胞儀檢測細胞周期的構成比。結果： (1)與溶劑對照組比較，各染毒組細胞活力隨著有機提取物濃度的增加及時間的延長而降低，差異有統計學意義(P<0.05)；(2)隨染毒劑量的增加，細胞周期中G0/G1期細胞比例逐漸下降，除24 h、48 h 0.312 5 L/mL染毒組外，其余劑量染毒組G0/G1期細胞比例均明顯低于溶劑對照組(P<0.05)；S期細胞比例則隨有機提取物濃度的增加而上升，除24、48及72 h 0.312 5 L/mL的染毒組外，其余染毒組中S期細胞比例的增加與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；染毒48 h、72 h后，L02細胞中G0/G1期細胞比例低于24 h染毒組(P<0.05)；S期細胞比例則高于24 h染毒組(P<0.05)。結論： 在本研究條件下，飲用水有機提取物可以阻滯L02細胞于S期，抑制細胞的增殖，且呈時間、劑量依賴性。

[關鍵詞]飲用水； 有機提取物； 肝細胞； 細胞增殖； 細胞周期

飲用水源中一般都含有一定濃度的天然有機物，工業廢水及城鎮生活污水[1]、廢氣和廢渣大量排放到自然水環境中，加之農業生產中農藥的大量使用，也會對水體造成了嚴重污染，影響飲水安全[2]。研究發現，水源有機物污染對人體有致畸、致癌、致突變、生殖毒性及細胞毒性等危害[3-5]。課題組前期的動物實驗發現，當地飲用水有機提取物可誘導雄性大鼠精子畸形、雄性激素分泌水平異常，同時可導致染色體斷裂、肝臟DNA損傷等[6-9]。本研究萃取G市某地飲用水的有機污染物，對人正常肝細胞系L02細胞進行染毒，觀察有機提取物對L02肝細胞的細胞增殖和細胞周期的影響。

1材料與方法

1.1實驗細胞、主要試劑及儀器

正常人肝L02細胞，來源于中科院昆明細胞庫。MTT細胞增殖檢測試劑盒(Solarbio 公司)，細胞周期檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所)，XAD-2大孔樹脂(20-60目，美國Sigma公司)，70%乙醇、甲醇、二氯甲烷(川東化工)，胰蛋白酶(Beyotime 公司)。旋轉蒸發儀(RE-3000，上海亞英生化儀器有限公司)，超級酶標儀(Max200， 美國Bio-Tek公司 )，流式細胞儀(FC500，貝克曼庫爾特商貿有限公司)。

1.2方法

1.2.1水樣采集與有機物提取采集G市某地管網末梢水，采用固相萃取法[10]富集水中有機物，萃取劑為XAD-2樹脂，洗脫劑為二氯甲烷和甲醇，水樣過柱流速為4倍柱體積/min，過柱完后依次用3倍柱體積的二氧甲烷和甲醇先后洗柱，流速0.1倍柱體積/min，洗脫液經旋轉蒸發儀25 ℃減壓蒸餾揮干，將已揮干的濃縮提取物用DMSO定容，-20 ℃冰箱保存備用。

1.2.2L02細胞培養及染毒劑量確定細胞培養基采用含10%胎牛血清的DMEM，并加入青霉素和鏈霉素，使其終濃度分別為100 U/mL和100 mg/L。將人肝L02細胞置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。用0.25%胰酶消化液消化細胞并傳代，取對數生長期細胞進行實驗。根據文獻[11]及預實驗結果，確定最高染毒劑量為5.000 0 L/mL，向下以2倍組距另設4個染毒劑量組，分別為2.500 0 L/mL、1.250 0 L/mL、0.625 0 L/mL和0.312 5 L/mL，同時設溶劑對照組(0.1%DMSO)和空白對照組(培養液)，處理時點為24 、48及72 h。

1.2.3MTT法檢測細胞的增殖情況取對數期生長的細胞，從培養瓶(25 cm2)中移去舊培養液，用PBS緩沖液輕柔漂洗2～3次，加入0.25%的胰蛋白酶1 mL消化，棄消化液后用新鮮培養液重懸，細胞計數后接種于細胞培養板，細胞在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱內貼壁培養24 h。每孔加入染毒培養基100 μL，每組設6個復孔，處理時點為24 h、48 h和72 h。細胞染毒結束后小心吸掉上清液，每孔中加入MTT溶液50 μL (5 g/L)，繼續培養4 h。棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μL， 室溫下平板搖床上搖晃10 min，測定光密度D(490 nm)值，并計算細胞存活率，細胞存活率(%)=實驗組D/對照組D×100。重復實驗3次。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞周期細胞染毒結束后，收集各組細胞懸液，2 000 r/min離心5 min，棄去上清液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次，用4 ℃預冷的70%乙醇固定2 h，PBS再洗滌3次，加入RNase至終濃度50 mg/L及碘化丙碇(PI)染液至終濃度50 mg/L，37 ℃孵育30 min后，用FC500 型流式細胞儀在 488 nm 波長下檢測 DNA 含量，分析細胞在增殖周期中 G 1期、 G 2 期和 S 期的分布。重復3次，計算細胞周期各時相的百分比。

1.3統計學方法

2結果

2.1L02細胞增殖活力

隨染毒劑量的增加，L02細胞增殖活力逐漸降低，各染毒組與溶劑對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。隨染毒時間延長，L02細胞增殖活力亦逐漸下降，48及72 h染毒組均明顯低于24 h染毒組(P<0.05)。見表1。

2.2L02細胞細胞周期

除24和48 h的0.312 5 L/mL染毒組外，其余染毒組L02細胞中G0/G1期細胞比例均隨染毒劑量的增加而明顯降低 (P<0.05)；除24、48 及72 h的0.312 5 L/mL染毒組外，其余染毒組L02細胞中S期細胞比例均隨染毒劑量的增加而明顯升高 (P<0.05)。48 和72 h染毒組，L02細胞G0/G1期細胞比例均明顯低于24 h染毒組(P<0.05)，而S期細胞比例則明顯高于24 h染毒組(P<0.05)。見表2、3、4。

表1　飲用水有機提取物染毒對L02細胞

(1)與同時點溶劑對照組比較，P<0.05

圖1　飲用水有機提取物對L02細胞增殖活力的影響Fig.1　Influence of organic extracts from drinking water on L02 cell proliferation

組別L02細胞周期(%)G0/G1SG2/M空白對照組 90.92±1.45 9.04±1.380.11±0.10溶劑對照組 89.75±1.1210.15±1.030.10±0.10有機提取物 0.3125L/mL組84.88±0.0912.38±0.012.74±0.08(1) 0.6250L/mL組83.93±0.77(1)15.66±0.64(1)0.40±0.26(1) 1.2500L/mL組79.46±0.20(1)19.36±0.20(1)1.19±0.04(1) 2.5000L/mL組77.41±1.70(1)20.02±0.55(1)3.57±0.52(1) 5.0000L/mL組74.51±0.15(1)20.75±1.43(1)4.75±1.51(1)

(1)與同細胞周期溶劑對照組比較，P<0.05

表3　飲用水有機提取物染毒48 h時

(1)與同細胞周期溶劑對照組比較，P<0.05

表4　飲用水有機提取物染毒72 h

(1)與溶劑對照組比較，P<0.05

3討論

圖2　飲用水有機提取物不同時間染毒對L02細胞周期變化的影響Fig.2　Changes of L02 cells cycle caused by organic extracts from drinking water during different time

生命體的重要特征是細胞通過分裂來增殖、分化，使個體發育、成熟并繁衍后代。由于MTT比色法可間接反映活細胞的多少，且使用酶標儀操作簡便、快速。因此，本研究采用MTT比色法檢測飲用水有機提取物對人肝L02細胞體外增殖的影響, 發現不同濃度飲用水有機提取物處理人肝L02細胞24、48及72 h后， 各染毒劑量均能顯著降低其增殖水平；從量效關系來看，各個作用時間點L02細胞活力均隨染毒劑量的增大而降低，具有劑量依賴性(P<0.05)。從時效關系看，有機提取物染毒48和72 h時L02細胞活力與染毒24 h時相比，差異均有統計學意義(P<0.05)。 該地飲用水有機提取物染毒濃度為0.312 5 L/mL,染毒時間為24 h時，即可抑制L02細胞的增殖。細胞增殖的抑制通常與細胞周期異常有關。一個細胞周期分為2個階段：分裂期和間期。分裂期是物質準備和積累階段，包括：G1期、S期及G2期[12-13]。趙淑華等[14]的研究顯示某地飲用水有機提取物染毒后，HL-7702細胞的增殖受抑，且可能與S期阻滯有關。由于各地污染物構成不同，其健康危害效應及可能機制不盡相同。為保障本地方人群健康，本實驗萃取飲用水有機污染物，觀察其肝細胞毒性，為后續深入研究奠定基礎。本地飲用水有機提取物染毒L02后，處理組的細胞周期出現異常， G0/G1期細胞比例明顯降低，S期細胞比例則顯著增加。S期是細胞周期的關鍵時點，DNA經過復制后，含量增加一倍，可順利進入G2期。而本研究中，該地飲用水有機污染物可阻滯細胞周期于S期，從而影響了人肝L02細胞的DNA合成，使其不能順利進入M期，結果導致細胞周期延長，不能正常分裂，從而抑制細胞增殖。目前，細胞周期調控的核心分子基礎是Cyclin、CDK和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKI)[15]。本實驗中細胞周期的阻滯、細胞增殖受抑是否與此有關，有待于進一步深入研究。

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(2015-12-22收稿，2016-02-23修回)

中文編輯： 周凌； 英文編輯： 趙毅

The Influence on Cell Proliferation and Cell Cycle of L02 Cells Exposed to Organic Extracts from Drinking Water

CEN Yanli， YANG Guanghong， GUI Xiaoling， ZHANG Aihua， LI Chuanmei

(SchoolofPublicHealth,GuizhouMedicalUniversity，Guiyang550025,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the influence of organic extracts from drinking water on liver cell (L02) proliferation and cell cycle. Methods: The L02 cells was cultivated in vitro: blank control group (culture solution), solvent control group (0.1%DMSO); organic extracts group (The dose of pollutants groups were 0.312 5, 0.625 0, 1.250 0, 2.500 0 and 5.000 0 L/mL samples were extracted by solid phase extraction method). Each group was treated for 24 h, 48 h and 72 h. Cell proliferation was measured by MTT assay. The constituent ratio of cell cycle was detected with flow cytometry. Results: (1) Compared with solvent control group, cell vitality of L02 cells decreased gradually with the increasing of exposure time and concentration of organic extracts. The differences were statistically significant (P<0.05). (2)The proportion of cells in G0/G1 phase decreased gradually with the increasing concentration of organic extracts. Except for 0.312 5 L/mL of pollutants group at 24 h and 48 h, significant differences were found in other exposure groups (P<0.05). The proportion of cell in S phase increased gradually with the increasing concentration of organic extracts. Except for 0.312 5 L/mL at 24 h, 48 h and 72 hr exposure, significant differences existed compared with solvent control group, differences were statistically significant (P<0.05). Compared with 24 h exposure group, exposed groups at 48 h-exposure and 72 h-exposure demonstrated significantly increase in G0/G1phase cell proportion and S phase cell proportion with increasing time (P<0.05). Conclusions: The results of the present paper showed that the organic extracts from drinking water can inhibit cell proliferation and change cell cycle of L02 cells.

[Key words]drinking water; organic extracts; hepatic cells; cell proliferation; cell cycle

[中圖分類號]R114

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)03-0294-04

*[基金項目]貴州省科技廳基金[黔科合LH字(2014)7102]； 貴陽市科學技術計劃項目[筑科合同(2013103)19號]

**貴州醫科大學2013級碩士研究生

***通信作者 E-mail:280446859@qq.com

網絡出版時間：2016-03-17網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160317.1029.024.html