146株流感嗜血桿菌的分離培養與耐藥分析

熊　冰，吳小娟，黃文紅

(華潤武鋼總醫院檢驗科，湖北武漢 430080)

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·臨床研究·

146株流感嗜血桿菌的分離培養與耐藥分析

熊冰，吳小娟，黃文紅

(華潤武鋼總醫院檢驗科，湖北武漢 430080)

摘要:目的了解住院患者呼吸道標本培養中流感嗜血桿菌(HIN)的培養分離檢出情況，同時結合藥物敏感試驗分析耐藥情況。方法使用哥倫比亞血瓊脂培養基，巧克力萬古瓊脂培養基結合革蘭染色圖片分離疑似流感嗜血桿菌，挑選可疑菌落進行衛星試驗和Ⅴ、Ⅹ、Ⅴ+Ⅹ因子需求試驗進行鑒定分離。用Nitrocefin 紙片法測定其β-內酰胺酶，采用紙片擴散法(K-B法)測定藥物敏感試驗結果，依照CLSI2012版標準判斷結果，利用WHONET 軟件對試驗數據進行處理和分析。結果146株流感嗜血桿菌培養陽性標本直接涂片鏡檢均為合格標本，β-內酰胺酶陽性的流感嗜血桿菌檢出率為32.6%(48/146)。146株流感嗜血桿菌對復方磺胺甲噁唑、氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、頭孢呋辛、亞胺培南、環丙沙星、頭孢噻肟、左氧氟沙星的耐藥率分別為64.4%、44.5%、17.1%、9.0%、0.0%、5.5%、2.7%、4.1%。β-內酰胺酶陽性的流感嗜血桿菌的耐藥率明顯高于β-內酰胺酶陰性株。結論實驗室人員應重視提高流感嗜血桿菌分離率。β-內酰胺酶是流感嗜血桿菌耐藥的主要機制，其耐藥問題不容忽視，應定期統計其藥物敏感試驗數據，為臨床使用抗菌藥物提供指導依據。

關鍵詞:流感嗜血桿菌；分離培養；β-內酰胺酶；耐藥性

流感嗜血桿菌是一類無動力、無芽孢的革蘭陰性小桿菌，是社區獲得性呼吸道感染的主要病原菌之一，也可侵入血液、皮膚黏膜引起腦膜炎、肺炎及敗血癥等嚴重感染。流感嗜血桿菌屬于苛氧菌，對其的分離培養反映著實驗室的鑒定水平；近年來，由于抗菌藥物的過度使用，其耐藥率不斷升高。為了解本院各科室呼吸道標本中流感嗜血桿菌的分離檢出情況和耐藥狀況，本文將對本科室2013年1月至2014年12月流感嗜血桿菌的分離培養與耐藥情況進行統計分析。

1資料與方法

1.1標本來源選擇本院2013年1月至2014年12月住院患者合格的呼吸道疑似標本395例，包括自然咳痰200例、導管吸痰130例、纖支鏡毛刷刷取物35例、肺泡灌洗液30例等。其中330例來自于成人標本，年齡19～71歲、平均(45±26)歲；65例來自于兒童標本，年齡3～14歲、平均(8±5.5)歲。

1.2試劑血平板、巧克力平板(含0.5 mg/mL萬古霉素)、水解酪蛋白(MH)培養基、HTM藥物敏感試驗培養基均由廣州迪景公司提供。Ⅴ、Ⅹ、Ⅴ+Ⅹ因子，復方磺胺甲噁唑、氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、頭孢呋辛、亞胺培南、環丙沙星、頭孢噻肟、左氧氟沙星藥物敏感試驗紙片均購自英國Oxoid公司。

1.3標準菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923、流感嗜血桿菌ATCC10211。

1.4方法

1.4.1菌株的分離與鑒定將收到的送檢標本同時接種于血平板和巧克力平板，37 ℃ CO2培養缸24 h培養后，挑取血平板上不長，巧克力平板上的透明或半透明、扁平、濕潤的露滴狀菌落涂片染色[1]，革蘭陰性桿菌列為疑似菌落重新轉種于巧克力平板，置37 ℃ CO2培養缸培養24 h后，挑取單個菌落配制成0.5麥氏濁度菌懸液，均勻涂布在MH瓊脂表面和血平板表面，置室溫干燥3～5 min，血平板上點種金黃色葡萄球菌進行衛星現象試驗，MH培養基貼Ⅴ因子、Ⅹ因子、Ⅴ+Ⅹ因子紙片，紙片間距24 mm，置37 ℃ CO2培養缸培養24 h后觀察。血平板上衛星試驗陽性同時不溶血的菌落，MH平板上同時需要Ⅴ因子、Ⅹ因子均為陽性的鑒定為流感嗜血桿菌。

1.4.2藥物敏感試驗試驗挑取鑒定合格的菌落，以流感嗜血桿菌ATCC10211為質控菌株，采用紙片擴散法(K-B法)分別進行復方磺胺甲噁唑、氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、頭孢呋辛、亞胺培南、環丙沙星、頭孢噻肟、左氧氟沙星8種抗菌藥物的敏感性測定，按美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)2012版[2]的判定標準測量抑菌圈直徑，以及判定耐藥和敏感。

1.4.3β-內酰胺酶試驗采用頭孢硝噻酚法，在頭孢硝噻酚紙片上加1滴無菌生理鹽水，紙片浸濕后將菌落涂布于紙片上，10 min 內變紅表示為β-內酰胺酶陽性菌株。

1.5統計學處理應用WHONET5.6對試驗數據進行統計分析。

2結果

2.1流感嗜血桿菌的分離培養情況395例疑似標本均為合格非重復標本，共分離出流感嗜血桿菌146株，均來自于住院患者痰標本。其中10歲以下兒童患者分離出56株，占38.4%；20～50歲患者分離出10株，占6.4%；60歲以上患者分離出80株，占54.8%。

表1　　146株流感嗜血桿菌對8種抗菌藥物的

續表1　　146株流感嗜血桿菌對8種抗菌藥物的

2.2藥物敏感試驗分析146株流感嗜血桿菌對復方磺胺甲噁唑、氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、頭孢呋辛、亞胺培南、環丙沙星、頭孢噻肟、左氧氟沙星的耐藥率分別為64.4%、44.5%、17.1%、9.0%、0.0%、5.5%、2.7%、4.1%。

2.3β-內酰胺酶試驗146株流感嗜血桿菌β-內酰胺酶陽性株共檢出48株(32.6%)，產酶株與不產酶株的耐藥率見表1。

3討論

流感嗜血桿菌較廣泛地寄居于健康人上呼吸道，通常以冬季帶菌率較高，發病也增多，可引起人類原發性化膿性感染，也可引起繼發性感染[3]。原發性感染由b型莢膜強毒株引起，為急性化膿感染，如腦膜炎、鼻咽炎、心包炎、敗血癥等，以小兒多見。繼發性感染主要在流感、麻疹、百日咳、肺結核等感染后發生，多為無莢膜菌株引起，如慢性支氣管炎、中耳炎、鼻竇炎等，多見于成年人。本研究中146例分離株均來自痰標本，說明流感嗜血桿菌主要引起上呼吸道感染。國外也有文獻報道流感嗜血桿菌引起泌尿生殖道炎癥，陽性率不高卻有著重要意義[4]，國內類似報道少見，這可能與流感嗜血桿菌的營養要求較高、普通血瓊脂平板上不易生長有關。流感嗜血桿菌的生長需要Ⅴ、Ⅹ因子，且在5%～10% CO2條件下才能生長，因此本研究采用加入萬古霉素的巧克力平板來分離臨床標本中的流感嗜血桿菌，加入0.5 mg/mL萬古霉素抑制革蘭陽性菌株和其他細菌的生長。

由于兒童及老年人的抵抗力較弱，所以比較容易感染此菌，近年來，流感嗜血桿菌的感染率呈上升趨勢，其分離鑒定對臨床診斷有較高的參考意義，因此各實驗室應重視對其的培養檢出。

由于抗菌藥物的過度使用，流感嗜血桿菌的耐藥率與耐藥范圍也在逐步擴大。本研究中對復方磺胺甲噁唑的敏感性已不足40%，該藥不再適合臨床使用；氨芐西林的耐藥率有44.5%，而產β-內酰胺酶株的耐藥率更是達到了100.0%，這說明產β-內酰胺酶是流感嗜血桿菌對氨芐西林耐藥的主要機制。青霉素類抗菌藥物原為治療流感嗜血桿菌的首選藥物，但是由于臨床濫用抗菌藥物，而導致氨芐西林的耐藥株不斷增多，給診斷和治療帶來一定的困難，這與桂和翠等[5]的研究報道結果一致。流感嗜血桿菌對氨芐西林的耐藥機制主要是菌株產生質粒介導的β-內酰胺酶，其中90%以上為TEM-1型基因，少數為ROB-1型基因所編碼，β-內酰胺酶水解了氨芐西林分子結構上的β-內酰胺環，使氨芐西林失去活性而耐藥。而β-內酰胺酶陰性株則主要是由染色體介導的青霉素結合蛋白的改變和細胞膜對抗菌劑通透性的改變引起，因此氨芐西林已不適用于臨床應用。本實驗室分離出的β-內酰胺酶陽性株占總株數的32.6%。

其他抗菌藥物頭孢呋辛、亞胺培南、頭孢噻肟、左氧氟沙星均較敏感，耐藥率較低，不超過10%，與趙蕾[6]的報道結果一致，因此在本院治療流感嗜血桿菌引起的呼吸道感染時，可優先選用頭孢呋辛、左氧氟沙星，必要時使用頭孢噻肟、亞胺培南。隨著抗菌藥物的用量和時間的關系，流感嗜血桿菌的耐藥性可能會發生改變，因此用藥過程中應定期進行細菌培養，尤其是對兒童患者和60歲以上中老年患者，調整抗菌藥物的種類和用量。微生物實驗室應重視和加強流感嗜血桿菌的培養及耐藥性監測工作以指導臨床醫生合理使用抗菌藥物。

參考文獻

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[4]Vazquez F,Andres MT,Palacio V,et al.Isolation of haemophilus influenzae and Haemophilus parainfluenzae in genitourinary infections:a 4-year review[J].Enferm Infecc Microbiol Clin，1996，14(3):181-185.

[5]桂和翠，王中新，沈繼錄.48株流感嗜血桿菌耐藥性分析及β-內酰胺酶基因檢測[J].安徽醫科大學學報，2012，47(1):56-59.

[6]趙蕾.57株流感嗜血桿菌的耐藥性分析及分布[J].中華實驗和臨床感染病雜志2013,7(4)：527-529.

(收稿日期：2015-12-20)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.06.032

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)06-0792-03