TIGAR調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力研究

趙　明，馮　婧，劉　勇，楊玲麟

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，四川瀘州 646000)

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·論著·

TIGAR調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力研究

趙明，馮婧，劉勇，楊玲麟△

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，四川瀘州 646000)

摘要:目的探討P53下游基因TIGAR在肺癌細(xì)胞A549增殖、遷移及侵襲中的作用。方法采用siRNA技術(shù)在A549細(xì)胞中干擾TIGAR的表達(dá)，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒 ( CCK-8)檢測(cè)細(xì)胞增殖，小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移，腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲，免疫印跡雜交檢測(cè)相關(guān)蛋白水平變化。結(jié)果在A549細(xì)胞中成功干擾TIGAR后，細(xì)胞增殖顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著減弱，侵襲相關(guān)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達(dá)量均下調(diào)。結(jié)論TIGAR促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549的增殖，并促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

關(guān)鍵詞:TIGAR；A549；增殖；遷移；侵襲

TIGAR是 2006 年發(fā)現(xiàn)的p53下游的一個(gè)直接靶基因[1]，在許多腫瘤中均呈現(xiàn)出異常表達(dá)。在乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7)細(xì)胞中，TIGAR通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白R(shí)B的去磷酸化來(lái)影響RB-E2F1的結(jié)合能力，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖[2]。TIGAR 的表達(dá)在腸上皮再生，小腸及結(jié)腸腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中也起著關(guān)鍵作用，在 TIGAR表達(dá)缺失的小鼠模型中腸上皮的增生能力明顯降低，小腸腺瘤的增殖能力也明顯下降[3]。因此，TIGAR 作為一個(gè)潛在的具有應(yīng)用前景的腫瘤治療靶點(diǎn)日益受到研究者的關(guān)注。本文選取肺癌細(xì)胞A549作為研究對(duì)象，探討干擾TIGAR對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的影響，以及細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。

1材料與方法

1.1細(xì)胞來(lái)源肺癌細(xì)胞A549，購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2儀器與試劑蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜裝置購(gòu)買于Bio-Rad(百樂(lè)公司);lipofectimine 2000(脂質(zhì)體)陽(yáng)離子脂質(zhì)體購(gòu)買于美國(guó)Invitrogen公司;CCK-8購(gòu)買于碧云天公司；transwell小室、基質(zhì)膠matrigel購(gòu)買于美國(guó)BD Bioscience公司；抗體TIGAR購(gòu)買于英國(guó)abcam公司，MMP-2抗體、MMP-9抗體購(gòu)買于武漢三鷹公司，GAPDH抗體購(gòu)買于美國(guó)Cell signaling technology公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染人肺癌細(xì)胞A549培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640，培養(yǎng)條件為5%CO2，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱。siRNA由上海GeneChem公司合成。Si-TIGAR序列為GCC AGC TTT ACT GGA GAA CTT，Si-Control序列為TTA CCG AGA CCG TAC GTA T。細(xì)胞分兩組，按照說(shuō)明書(shū)分別轉(zhuǎn)染Si-TIGAR和Si-Control，5 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.2CCK-8接種細(xì)胞于96孔板，轉(zhuǎn)染48 h后加入CCK-8 10 μL于每孔，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm吸光值。

1.3.3小室法和腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)對(duì)于小室法無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至3×105/mL，接種100 μL于transwell小室上室，下室加入600 μL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)20 h后，棉球擦去上室細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，顯微鏡觀察拍照。對(duì)于腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，上室需提前加入50 μL基質(zhì)膠matrigel,48 h后棉球擦去上室細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，顯微鏡觀察拍照。

1.3.4免疫印跡雜交轉(zhuǎn)染后72 h收集細(xì)胞，提取總蛋白，10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳，蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF纖維素膜上后，3%脫脂牛奶封閉1 h后，加入一抗，4 ℃搖床過(guò)夜，TBST洗滌后，二抗孵育1 h，洗脫液TBST洗滌后顯色試劑ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析，組間比較使用配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1干擾TIGAR效率檢測(cè)轉(zhuǎn)染Si-TIGAR和Si-Control 72 h后，免疫印跡雜交檢測(cè)干擾組TIGAR表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，具有較高的干擾效率，見(jiàn)圖1。

圖1　　TIGAR表達(dá)水平

2.2干擾TIGAR后細(xì)胞增殖檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h后，加入CCK-8檢測(cè)增殖發(fā)現(xiàn)，干擾組細(xì)胞數(shù)量顯著低于對(duì)照組，干擾TIGAR后，細(xì)胞增殖速率降低，見(jiàn)圖2。

圖2　　細(xì)胞增殖檢測(cè)

2.3干擾TIGAR后細(xì)胞遷移和侵襲檢測(cè)接種后20 h，結(jié)晶紫染色遷移組細(xì)胞，觀察到干擾組細(xì)胞比對(duì)照組顯著減少，證明細(xì)胞遷移能力降低；接種后48 h，結(jié)晶紫染色侵襲組細(xì)胞，觀察到干擾組細(xì)胞比對(duì)照組顯著減少，證明細(xì)胞侵襲能力降低，見(jiàn)圖3。

圖3　　細(xì)胞遷移、侵襲檢測(cè)

2.4干擾TIGAR后侵襲相關(guān)蛋白檢測(cè)免疫印跡雜交檢測(cè)侵襲相關(guān)蛋白MMP-2，MMP-9表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在干擾組中表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，見(jiàn)圖4。

圖4　　MMP-2，MMP-9表達(dá)量

3討論

腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，首先需要突破細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的屏障才能向周圍組織侵襲，進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是降解ECM最重要的蛋白酶。已有文獻(xiàn)報(bào)道在食管癌、胃癌、結(jié)腸癌等腫瘤中MMPs均呈現(xiàn)出過(guò)表達(dá)。因此，研究MMPs在肺癌中的表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制具有重要意義[4-9]。

TIGAR是P53下游的靶基因，在TIGAR表達(dá)缺失的小鼠結(jié)腸腫瘤模型中，結(jié)腸腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到肺等器官的能力降低[10-12]，證明了TIGAR在腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程中起到非常重要的作用[3]。通過(guò)此研究，發(fā)現(xiàn)通過(guò)siRNA技術(shù)干擾TIGAR可降低MMP-2、MMP-9的表達(dá)[13-14]，從而減弱肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，加深了對(duì)于肺癌轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，具有重要的指導(dǎo)意義。

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TIGAR promotes proliferation and invasiveness of lung cancer cells

ZhaoMing，F(xiàn)engJing，LiuYong，YangLinglin△

(DepartmentofOncology,theAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou,Sichuan646000,China)

Abstract:ObjectiveTo study the role of P53 target gene TIGAR on proliferation,migration and invasion of lung cancer cells.MethodssiRNA was introduced to knock down TIGAR in A549 cells.Proliferation was detected by CCK-8.The ability of migration and invasion was measured by and,respectively.was used to evaluate the expression levels of related proteins.ResultsKnockdown of TIGAR reduced the proliferation rate(P<0.05),inhibited the ability of migration and invasion,decreased expression levels of MMP-2 and MMP-9.ConclusionTIGAR promotes proliferation,migration and invasiveness of lung cancer cells.

Key words:TIGAR；A549；proliferation；migration；invasion

(收稿日期：2015-11-26)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.06.014

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)06-0754-02

作者簡(jiǎn)介：趙明，男，檢驗(yàn)技師，主要從事臨床檢驗(yàn)研究。(△)通訊作者，E-mail：yangllluyi@126.com。