正交實驗優選甘草總黃酮和總皂苷提取工藝*

趙　妮，鄧　毅△，劉　靚，董金香，曼　瓊甘肅中醫藥大學，甘肅蘭州730000；甘肅省中(藏)藥化學與質量研究省級重點實驗室

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正交實驗優選甘草總黃酮和總皂苷提取工藝*

趙妮1，鄧毅1△，劉靚2，董金香2，曼瓊2
1甘肅中醫藥大學，甘肅蘭州730000；2甘肅省中(藏)藥化學與質量研究省級重點實驗室

［摘要］目的：優化甘草總黃酮和總皂苷的超聲提取工藝。方法：以提取溫度、提取時間、乙醇濃度、料液比為考察因素，以總黃酮和總皂苷含量為綜合評分作為評價指標，優選出最佳提取工藝。結果：最佳提取工藝：提取溫度為50℃，提取時間為45分鐘，乙醇濃度為60％，料液比為1∶10。結論：該提取工藝簡便、快捷，可用于甘草總黃酮、總皂苷的同時提取，為甘草進一步研究與利用奠定基礎。

［關鍵詞］甘草；總黃酮；總皂苷；正交實驗；提取工藝

Optimization of Extraction Technology of Total Flavonoids and Total Saponins from GanCao by Orthogonal Test

ZHAO Ni1,DENG Yi1△,LIU Liang2,DONG Jinxiang2,MAN Qiong2
1 Gansu University of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China;2 Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese Medicines of the College of Gansu Province

Abstract Objective:To optimize ultrasonic extraction technology of total flavonoids and total saponins from GanCao (Glycyrrhiza uralensis Fisch.).Methods:The best extraction technology was optimized by taking extraction temperature,extraction time,the concentrations of ethanol and solid-liquid ratio as the factors,the contents of total flavonoids and total saponins as evaluation indexes for comprehensive assessment.Results:The best extraction technology was:extraction temperature:50℃,extraction time:45 minutes,the concentrations of ethanol:60％,solid-liquid ratio:1:10.Conclusion:The extraction technology,simple,convenient and rapid,could be used for simultaneous extraction of total flavonoids and total saponins from GanCao,which could lay foundation for further study and utilization of GanCao.

Keywords GanCao;total flavonoids;total saponins;orthogonal test;extraction technology

甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)是豆科甘草屬(Glycyrrhiza)植物甘草的根和根莖，在中醫處方中占有重要地位，素有“十方九草”之稱［1-3］。甘草的活性成分主要包括三萜皂苷類和黃酮類，兩者都具有保肝、抗病毒、抗菌、抗炎、抗氧化等作用［4］。內生菌(Endophyte)是指存活于健康植物組織內部，而又不引發宿主植物表現出明顯感染癥狀的微生物類群，包括真菌、細菌和放線菌。20世紀90年代，有學者發現與植物長期共存的內生菌能產生與宿主植物相同或相似的活性成分后得到重視，并成為研究的熱點。有研究表明［5］，甘草內生菌代謝產物具有與甘草藥材相同或相似的生理活性，為此，筆者采用正交實驗優選甘草總黃酮、總皂苷的最佳提取工藝，較大程度地提取甘草中的總黃酮和總皂苷，為甘草總黃酮和總皂苷的純化，以及為后期研究甘草藥效成分和其內生菌代謝產物活性成分間的相關性奠定基礎。

1　材料

1.1儀器723型紫外分光光度計(廈門分析儀器廠提供)；KQ-500DE型數控超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司提供)；HH-S數顯恒溫水浴鍋(江蘇正基儀器有限公司提供)；臺式低速離心機(長沙平凡儀器儀表有限公司提供)；BS-110S型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司提供)。

1.2試藥甘草采自甘肅省酒泉市金塔縣，經甘肅中醫藥大學中藥鑒定實驗中心高級實驗師林麗鑒定為正品；甘草酸銨鹽(江蘇永健醫藥科技有限公司生產，批號：YJ-140227)；甘草苷(江蘇永健醫藥科技有限公司生產，批號：YJ-150310)；無水乙醇、甲醇、氫氧化鈉、香草醛、冰乙酸、高氯酸均為分析純。

2　方法與結果

2.1甘草總黃酮和總皂苷的含量測定

2.1.1提取方法精準稱取甘草粉末0.2 g于50 mL錐形瓶中，加10倍量體積的60％乙醇，50℃超聲提取45分鐘，離心，得甘草提取液。

2.1.2對照品溶液的制備精密稱定甘草苷和甘草酸銨鹽，分別定溶于10 mL容量瓶中，制得濃度為0.161 7、0.508 2 mg/mL的甘草苷和甘草酸銨鹽對照品溶液。

2.1.3甘草苷標準曲線［6］精密吸取甘草苷對照品溶液0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL依次置于10 mL的容量瓶中，各加入70 ％甲醇溶液1 mL搖勻后，再加10 ％ NaOH溶液2.5 mL顯色，10分鐘后用70％甲醇溶液定容，在410 nm波長下分別測定吸光度值，并以甘草苷質量(Y)為自變量，吸光度(X)為因變量，得回歸方程：Y=0.3898X－0.0133，r2=0.999 4，甘草苷在0.025～0.407 mg線性關系良好。

2.1.4甘草酸銨鹽標準曲線［7］精密吸取甘草酸銨對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2、3 mL于試管中，揮干溶劑，加5％香草醛-冰醋酸溶液0.25 mL，搖勻，加0.8 mL高氯酸，搖勻，在56℃水浴反應20分鐘，取出自來水冷至室溫，用不含對照品的溶劑作為空白，在589 nm波長處測定吸光度，并以甘草酸銨質量(Y)為自變量，吸光度(X)為因變量，得回歸方程：Y=0.655 7X-0.042 7，r2=0.999 4甘草酸銨鹽在0.016～0.485 mg線性關系良好。

2.1.5精密度實驗精密吸取甘草苷和甘草酸銨鹽對照品溶液0.4 mL、1.5 mL分別定溶于10 mL錐形瓶中，分別按“2.1.3”和“2.1.4”項下方法測定吸光度，平行操作5次。結果RSD甘草苷=0.16％，RSD甘草酸銨鹽=0.14 ％。表明儀器精密度良好。

2.1.6加樣回收率實驗［8］精密吸取9份甘草提取液各5.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，分別加入甘草苷對照品溶液2.0、4.0、6.0 mL，配成低、中、高濃度溶液各3份，按“2.1.3”項下方法分別顯色后測定其吸光度，計算加樣回收率。結果，平均加樣回收率為101.7 ％，RSD=1.62 ％(n=9)。另精密吸取9份甘草提取液各5.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，分別加入甘草酸銨鹽對照品溶液2.0、4.0、6.0 mL，配成低、中、高濃度溶液各3份，按“2.1.4”項下方法分別顯色后測定其吸光度，計算加樣回收率。結果平均加樣回收率為99.8％，RSD=1.23 ％(n=9)。

2.1.7含量測定精密吸取甘草提取液適量，分別按“2.1.3”和“2.1.4”項下方法分別測定總黃酮和總皂苷的吸光度，代入各自回歸方程，計算二者含量。

2.2甘草總黃酮和總皂苷最佳工藝優選

2.2.1正交實驗設計為尋求最佳提取組合，本實驗中選用提取溫度、提取時間、乙醇濃度、料液比作為考察對象，每個因素3個水平，以總黃酮和總皂苷含量為綜合評分作為評價指標，進行L9(34)正交試驗。因素表見表1。

2.2.2正交實驗結果按照L9(34)正交設計表的條件進行實驗，分別測定甘草總黃酮和總皂苷的含量。采用信息熵權重分析法確定總黃酮(A)和總皂苷(B)的權重系數分別為0.5，根據各指標的權重，計算綜合評價指標，對正交實驗數據進行綜合分析。綜合評分=(0.5A/17.285 3+0.5B/12.927 2)×100％。方差分析結果見表2，正交實驗結果見表3。

表1　甘草總黃酮及總皂苷提取工藝水平因素

表2　綜合評分方差分析結果

表3　甘草總黃酮、總皂苷提取工藝正交

由表2和表3可知B＞D＞A＞C，即提取時間＞料液比＞提取溫度＞乙醇濃度，4個因素對提取率都有極顯著性影響。最佳提取工藝條件為：A3B3C2D1，即提取溫度為50℃，提取時間為45分鐘，乙醇濃度為60％，料液比為1∶10。

2.2.3驗證實驗精密稱取0.2 g甘草藥材粉末，按上述最佳提取工藝條件提取，按“2.1.3.1”和“2.1.3.2”項下方法進行含量測定，平行提取3次，測定總黃酮和總皂苷的吸光度。結果綜合評分：1.017 1、1.009 1、0.995 3 mg/g，RSD=1.09％(n=3)。表明提取工藝可靠、穩定、可行。

3　討論

以蘆丁作為對照品來測定總黃酮含量是最普遍、最常用的方法。蘆丁屬于黃酮醇類化合物，但是，甘草中黃酮類成分以二氫黃酮類(甘草苷、甘草素)和查耳酮類(異甘草苷、異甘草素)為主。因此，選用甘草中含量較高的甘草苷為對照品比選用蘆丁更合理，誤差更小。二氫黃酮類成分在10％氫氧化鈉堿性條件下可以轉化成查耳酮，利用這一的特性來測定甘草總黃酮的含量，可使測定結果更加準確、可靠。

香草醛在放置過程中易氧化而使顏色加深［9］，因此，在測定總皂苷含量時，香草醛-冰醋酸溶液需現配先用，并應盡量保證測量條件的一致性，以免引起誤差。顯色反應過程中，吸光度隨著時間、溫度、顯色劑用量的改變而改變，本實驗在測定甘草總皂苷的過程中嚴格控制了顯色時間、反應溫度、顯色劑用量等條件，以防這些因素的改變而影響實驗結果的準確性。

本實驗利用正交實驗優選總黃酮和總皂苷可以同時提取的最佳提取工藝，并以總黃酮(甘草苷、甘草苷元、異甘草苷等)和總皂苷(甘草酸、甘草次酸、異甘草次酸等)為綜合評價指標，對甘草進行提取工藝研究，為甘草藥效成分的純化以及研究甘草內生菌代謝產物與甘草藥材活性成分間的相關性奠定基礎。在處理數據時，為了便于比較分析，對各指標數據進行必要的標準化處理，采用的是Ci/Cmax，即數據除以該組最大數據。

參考文獻

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［9］張中偉，謝明勇，王遠興，等.比色法測定苦瓜總皂苷［J］.南昌大學學報，2005，29(5):447-449．

通訊作者：△鄧毅(1964—)，男，碩士研究生導師，教授，中藥學科學術帶頭人。研究方向：中藥學教學、中藥性能與配伍應用及中藥不良反應的研究。

作者簡介：趙妮(1988—)，女，在讀碩士研究生。研究方向：中藥及復方應用研究。

*基金項目：國家自然科學基金項目（編號81360633）。

收稿日期：2015-07-20

［中圖分類號］R284.2

［文獻標識碼］A

［文章編號］1004-6852(2016)02-0034-03