內蒙古地區菠菜猝倒病病原菌鑒定

銀 玲京山幸二田 迅李依韋冀照君趙 汝

（1內蒙古民族大學生命科學學院，內蒙古通遼 028000；2岐阜大學流域圈科學研究中心，日本岐阜 501-1193）

內蒙古地區菠菜猝倒病病原菌鑒定

銀 玲1京山幸二2田 迅1李依韋1冀照君1趙 汝1

（1內蒙古民族大學生命科學學院，內蒙古通遼 028000；2岐阜大學流域圈科學研究中心，日本岐阜 501-1193）

在內蒙古通遼市、包頭市和巴彥淖爾市郊區大棚蔬菜種植區采集菠菜幼苗猝倒病病株，采用形態學和分子生物學方法對分離得到的病原物進行鑒定，并采用平板法測定代表菌株的致病性。結果表明：從82份病樣中共獲得60株腐霉菌株，分別為德里腐霉（Pythium deliense Meurs）、瓜果腐霉〔Pythium aphanidermatum（Edson）Fitzp〕和終極腐霉（Pythium ultimum Trow var. ultimum）。這3種腐霉均為菠菜猝倒病致病菌，但是發病率有所不同，P. deliense的發病率最高，為85.7%；其次是P. aphanidermatum，發病率為42.9%；發病率最低的是P. ultimum var. ultimum，為28.6%。

內蒙古；菠菜猝倒?。桓咕?；rDNA-ITS

菠菜（Spinacia oleracea L．）別名波斯草、赤根菜、角菜，是黎科菠菜屬中以綠葉為主要產品器官的一、二年生草本植物，原產于中亞，已有逾1 300年的栽培歷史（Yamaguchi，1983）。早在7世紀菠菜就傳入中國，目前在全國范圍內被廣泛種植，年產量約2 500萬t，占世界菠菜總產量的89.2%（錢偉 等，2014）。菠菜喜冷涼，生長最適溫度15～20 ℃，在我國北方露地難以周年生產。隨著設施農業的發展，菠菜種植不僅擺脫了自然氣候、季節的制約，還提高了單產，保證了全年均衡供應。但設施栽培容易形成高濕的不利環境，加上長期連作，加劇了土傳病害的發生為害，其中與猝倒病和根腐病有關的土傳病菌有：尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum Schl.）、瓜果腐霉〔Pythium aphanidermatum（Edson）Fitzp〕、立桔絲核菌（Rhizoctonia solani K ü hn）、螺殼狀絲囊霉（Aphanomyces cochlioides Drechs）等（Sumner et al.，1976；Naiki et al.，1986；Sumner，1991；Larsson & Gerhardson，1992），被這些病原菌侵染的菠菜，出苗前和出苗后均有病害發生。在國內，已有關于粉霜霉菠菜?；汀睵eronospora farinosa（Fries）Fries f. sp. Spinaciae〕引起的菠菜霜霉?。ㄌ锢?等，1993）和菠菜匍柄霉（Stemphylium botryosum）引起的葉斑病（Zhou et al.，2011）的報道。但是關于腐霉屬菌引起菠菜病害的報道很少。本試驗在內蒙古東部地區的通遼市和西部地區的包頭市及巴彥淖爾市郊區采集菠菜幼苗猝倒病病株，對其病原物進行分離鑒定及致病性測定，以期明確內蒙古地區菠菜猝倒病病原菌的主要種類。

1 材料與方法

1.1 病樣采集

2012年在內蒙古通遼市、包頭市和巴彥淖爾市郊區大棚蔬菜種植區，采用隨機采集的方式，把具有典型猝倒病癥狀的菠菜幼苗整株連根帶土挖出，裝入潔凈塑料袋，標明編號、地點、采集時間，帶回實驗室4 ℃保存。其中，包頭市選擇2個大棚，每個大棚采集18株病株，共計36株；巴彥淖爾市選擇2個大棚，每個大棚采集15株病株，共計30株；通遼市選擇1個大棚，采集16株病株。

1.2 病原菌分離

選擇發病較輕的菠菜幼苗，在根系發病部位剪取3塊5 mm左右的組織，先用自來水洗凈表面，再用無菌水沖洗3次，吸干表面水分。將樣品置于腐霉屬菌選擇性培養基NARM培養基（1 000 mL CMA培養基中加入制霉菌素10 mg、氨芐青霉素250 mg、利福平10 mg和咪康唑1 mg，蒸餾水1 000 mL，滅菌）平板上（Morita & Tojo，2007），25 ℃暗培養。2～3 d后將菌落邊緣菌絲轉移至新的NARM培養基上，進行純化并編號保存。

1.3 形態學鑒定

1.3.1 鑒定依據 主要參考van der Plaats-Niterink（1981）和余永年（1998）的方法，根據孢子囊、雄器、藏卵器、卵孢子等的形態特征進行鑒定。

1.3.2 觀察方法 采用草葉誘導法（Waterhouse，1967）誘導產生孢子囊、游動孢子、藏卵器、雄器和卵孢子等。將斜面試管保存的菌株轉移至CMA培養基平板上，菌絲即將長滿培養皿時用直徑6 mm的滅菌打孔器打取圓形菌苔1塊，置于新的CMA培養基平板上，將草坪草的葉片滅菌之后切成長5 mm的小段，放在菌絲塊的周圍，25 ℃暗培養。草葉被侵染后，放入已經滅菌的10 mL池塘水（V池塘水∶V蒸餾水=1∶2）中，25 ℃暗培養。誘導培養2～14 d內觀察孢子囊、游動孢子、藏卵器、雄器及卵孢子的形態特征，以顯微攝影作記錄。

1.4 分子生物學鑒定

1.4.1 基因組DNA提取 將斜面試管保存的菌株轉移至CMA培養基平板上，25 ℃暗培養，待長出菌落后在菌落邊緣用直徑6 mm的滅菌打孔器打取5塊菌苔，置于50 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養基上，180 r·min-1、25 ℃振蕩培養5 d后，挑取適量的菌絲體，抽濾、晾干。采用由北京索萊寶科技有限公司提供的真菌基因組DNA提取試劑盒，按其說明書進行DNA提取。

1.4.2 rDNA-ITS序列分析 利用引物ITS1（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）和ITS4（5′-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3′）（White et al.，1990）對提取的基因組DNA進行PCR擴增，引物由北京華大基因研究中心合成。PCR反應體系（50 μL）：10×Taq反應緩沖液5 μL，1.5 mmo1·L-1MgCl23 μL，0.2 mmo1·L-1dNTPs 1 μL，0.5 μmo1·L-1引物2 μL，200 ng模板DNA 2 μL，5 U Taq DNA聚合酶0.5 μL，加ddH2O補足50 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min；94℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環；72 ℃延伸10 min，最終4 ℃保存。PCR產物經2.0%瓊脂糖凝膠電泳、EB染色，在紫外燈下拍照檢測，之后送中國農業科學院作物科學研究所進行雙向測序。將測序獲得的ITS序列用ChromasPro軟件拼接校正，通過BanKit提交序列至NCBI，獲得的序列登錄號見表1。

進一步通過NCBI進行BLAST同源性比較，從GenBank中下載作為外群的致病疫霉Phytophthora infestans（Mont.）de Bary和與自測菌株相似度98%以上的腐霉模式菌株及其ITS序列，使用Clustal X（1.81）軟件和MEGA 3.1軟件進行分析，采用距離法構建系統發育樹。

表1 供試腐霉菌株及其序列登錄號

1.5 致病性測定

采用平板法進行致病性測定。將提取基因組DNA獲得的含有大量菌絲的液體倒入直徑9 cm的玻璃培養皿中，與滅菌栽培土混勻，覆蓋塑料薄膜，25 ℃發酵1～3 d；用3%雙氧水浸泡菠菜種子3 min進行表面消毒，然后用無菌水沖洗3次，25 ℃催芽；將發芽的種子播于腐霉發酵平皿培養土中，每皿7粒，置于人工氣候培養箱中25 ℃培養、觀察；以不接菌為對照，統計發病幼苗數，計算發病率。

發病率=猝倒死亡幼苗數/播種種子數×100%

2 結果與分析

2.1 病害癥狀

菠菜猝倒病在內蒙古通遼市、包頭市和巴彥淖爾市郊區蔬菜大棚種植區均有發生。病害癥狀：幼苗出土后至3～4片真葉前，在小苗尚未萎蔫、葉片仍然保持綠色時就出現倒伏現象，最終萎蔫死亡。發病植株地表或地下的莖基部縊縮呈黃褐色，可向上、下擴展使發病部位呈細線狀。該病發展迅速，初期僅有個別植株發病，幾天后便以此為中心向周圍蔓延，植株成片猝倒死亡。

2.2 病原菌分離結果

從82份菠菜猝倒病病樣中共分離出60株腐霉菌株，其中通遼市17株、包頭市26株、巴彥淖爾市17株。通遼市分離得到的17株菌株中，瓜果腐霉（P. aphanidermatum）9株，占分離總數的52.94%；終極腐霉（P. ultimum var. ultimum）8株，占47.06%；由此可見，通遼市郊區菠菜猝倒病病原菌以瓜果腐霉和終極腐霉為主。包頭市分離得到的26株菌株中，德里腐霉（P. deliense）15株，占分離總數的57.69%；終極腐霉（P. ultimum var. ultimum）11株，占42.31%；說明德里腐霉和終極腐霉是包頭市郊區菠菜猝倒病的主要病原菌。分離自巴彥淖爾市的17株菌株全部都是德里腐霉（P. deliense）。

2.3 病原菌鑒定結果

2.3.1 形態學鑒定結果 以Bts1-6b和Bts1-8a為代表的32株菌株的菌落在CMA培養基上呈放射狀，菌絲基內生；孢子囊瓣狀，常分枝或成簇頂生；藏卵器球形、近球形，直徑14.4～30.1 μm，平均24.2 μm，多為頂生，大多數藏卵器柄明顯彎向雄器；雄器多為同絲生，短棍棒狀、彎棍棒狀或囊袋狀，每個藏卵器有1～2個雄器；卵孢子球形，直徑13.4～30.1 μm，平均26.6 μm，不滿器（圖1-a、b、c）。

以H11-1和H11-2為代表的9株菌株的菌落在CMA培養基上無特定的形態，有大量氣生菌絲；孢子囊為姜瓣狀或不規則膨大菌絲；藏卵器多為頂生，球形，光滑，藏卵器柄較直，直徑21.6～39.5 μm，平均26.8 μm；每個藏卵器上附著1～2個雄器，雄器同絲生、異絲生或間生，多數有柄，屋頂狀、袋狀或玉米粒狀；卵孢子球形，直徑13.9～23.4 μm，平均20.0 μm，多數不滿器（圖1-d、e、f）。

以H1-2和Bts-20b為代表的19株菌株的菌落在CMA培養基上無特定的形態，氣生菌絲發達；菌絲膨大體近球形，頂生或多間生，直徑13.1～21.5 μm，平均18.1 μm；藏卵器球形，平滑，多頂生，直徑17.2～20.1 μm，平均18.4 μm；每個藏卵器有1～2個雄器，無柄，多緊貼藏卵器形成，彎曲、囊狀，多同絲生，偶有異絲生和下位生；卵孢子球形，平滑，不滿器，直徑13.7～17.7 μm，平均15.5 μm（圖1-g、h、i）。

以上3種腐霉菌株的形態特征分別與van der Plaats-Niterink（1981）描述的德里腐霉（P. deliense）、瓜果腐霉（P. aphanidermatum）以及終極腐霉（P. ultimum var. ultimum）一致。

2.3.2 rDNA-ITS序列分析結果 從經形態學觀察初步鑒定的3種腐霉菌中分別選擇2個代表菌株：Bts1-6b和Bts1-8a（P. deliense）、H11-1和H11-2（P. aphanidermatum）以及H1-2和Bts-20b（P. ultimum var. ultimum），分別提取基因組DNA，測定rDNA-ITS序列。獲得的序列長度分別為774、773 bp，777、777 bp，826、825 bp。將所測ITS序列通過NCBI進行BLAST比對，菌株Bts1-6b、Bts1-8a以及H11-1、H11-2與德里腐霉菌株CBS11484的相似度為99%（HQ643520.1）、與CBS31433（HQ643522.1）和CBS314.33（AY598674.2）的相似度為98%，與瓜果腐霉菌株CBS118.80（AY598622.2）、CBS28779（HQ643439.1）和CBS11880（HQ643438.1）的相似度為99%。依據該結果無法判斷這4株菌株是屬于德里腐霉還是瓜果腐霉。H1-2、Bts-20b與終極腐霉菌株CBS398.51（AY598657.2）、CBS39851（HQ643865.1）和CBS291.31（KJ639270.1）的相似度為99%，可以確定這2株菌株為終極腐霉。

聚類分析結果表明（圖2），菌株Bts1-6b和Bts1-8a與德里腐霉菌株HQ643520.1、HQ643522.1和AY598674.2的同源性較高，聚為一類；菌株H11-1和H11-2與瓜果腐霉菌株AY598622.2、HQ643439.1和HQ643438.1的親緣關系最密切，聚為一類；說明菌株Bts1-6b和Bts1-8a是德里腐霉，而菌株H11-1和H11-2是瓜果腐霉。菌株H1-2和Bts-20b與終極腐霉菌株AY598657.2、HQ643865.1和KJ639270.1聚為一類，進一步證實了這2株菌株為終極腐霉。

圖1 菠菜猝倒病病原菌形態特征a、b、c，以Bts1-6b和Bts1-8a為代表的菌株的孢子囊、藏卵器、雄器和卵孢子；d、e、f，以H11-1和H11-2為代表的菌株的孢子囊、藏卵器、雄器和卵孢子；g、h、i，以H1-2和Bts-20b為代表的菌株的菌絲膨大體、藏卵器、雄器和卵孢子；標尺=10 μm。

2.4 致病性測定結果

從分離鑒定的3種腐霉菌中分別選擇1個代表菌株Bts1-6b（P. deliense）、H11-1（P. aphanidermatum）和H1-2（P. ultimum var. ultimum），采用平板法進行致病性測定。結果表明（圖3），接種3個菌株的菠菜幼苗均出現子葉仍為綠色、萎蔫前即從莖基部倒伏的現象；拔出幼苗后發現莖基部明顯變為黃褐色，縊縮成細線狀。而對照植株生長正常。

從病株發病部位再次分離腐霉菌，觀察其孢子囊、藏卵器和雄器等，鑒定結果表明分離得到的菌株與原始接種菌株在形態特征上一致，表明所接種的3株菌株均為菠菜猝倒病的病原菌。

統計發病幼苗、計算發病率，結果顯示接種菌株Bts1-6b（P. deliense）的發病率最高，為85.7%；其次是菌株H11-1（P. aphanidermatum），發病率為42.9%；發病率最低是菌株H1-2（P. ultimum var.ultimum），為28.6%。

圖2 基于rDNA-ITS基因序列的腐霉菌聚類分析結果

圖3 腐霉菌對菠菜幼苗的致病性測定結果

3 結論與討論

本試驗采用腐霉屬菌選擇性培養基（NARM培養基）對菠菜猝倒病病樣進行病原菌分離純化，以傳統形態學鑒定為基礎，結合rDNA-ITS序列分析以及致病性測定，初步確定內蒙古地區菠菜猝倒病病原菌為德里腐霉（P. deliense）、瓜果腐霉（P. aphanidermatum）和終極腐霉（P. ultimum var. ultimum）。這3種腐霉菌在內蒙古通遼市、包頭市和巴彥淖爾市的出現頻率不同，可能是與不同地區氣溫、采樣時間等有關。

菠菜猝倒病在世界各地普遍發生，不同國家和地區菠菜猝倒病病原菌的分布情況有所不同。Bates和Stanghellini（1984）認為，美國亞利桑那州的菠菜猝倒病病原菌為瓜果腐霉（P. aphanidermatum）和寬胸腐霉（P. dissotocum）。Naiki等（1986）報道日本岐阜縣的菠菜猝倒病病原菌為側雄腐霉（P. paroecandrum）和瓜果腐霉（P. aphanidermatum），其中優勢種為P. paroecandrum；Akashi等（1986）報道日本北海道的菠菜猝倒病病原菌為Pythium sp. 、終極腐霉（P. ultimum）、瓜果腐霉（P. aphanidermatum）以及刺腐霉（P. spinosum），其中Pythium sp. 和P. ultimum為優勢種群。瑞典報道林器腐霉（P. sylvaticum Huds）、終極腐霉（P. ultimum var. ultimum）和異宗結合腐霉（P. heterothallicum）為當地菠菜猝倒病病原菌（Larsson，1994）。

本試驗中分離得到的瓜果腐霉（P. aphanidermatum）和終極腐霉（P. ultimum var. ultimum）廣泛分布于世界各地，為害多種植物，引起幼苗猝倒、成株根腐、莖腐和果腐等（van der Plaats-Niterink，1981）。德里腐霉（P. deliense）是最初由Meurs從印度尼西亞煙草上分離獲得的，并命名為Pythium deliense Meurs（Meurs，1934）。P. deliense可以引起蔞葉（Lodhi et al.，2004）、哈密瓜（Teymoori et al.，2012）和花生（Parkunan et al.，2014）等植物病害。本文是P. deliense作為菠菜猝倒病病原菌的首次報道。

錢偉，張合龍，劉偉，徐兆生．2014．菠菜遺傳育種研究進展．中國蔬菜，（3）：5-13．

田黎，日孜旺古麗，陳舒云，馬丹江．1993．新疆菠菜霜霉病的侵染及防治．新疆農業科學，（1）：24-25．

余永年．1998．中國真菌志（第六卷·霜霉目）．北京：科學技術出版社：54-138．

Akashi K，Maeda K，Abe H．1986．Studies on root diseases of spinach and soil scientific research on the occurrence Ⅱ．pathogens of damping-off occurring in fields around Sapporo city．Bulletin of Hokkaido Prefectural Agricultural Experiment Stations，54：1-8．

Bates M L，Stanghellini M E．1984．Root rot of hydroponically grown spinach caused by Pythium aphanidermarwn and P. dissorocum．Plant Disease，68：989-991．

Larsson M，Gerhardson B．1992．Disease progression and yield losses from root diseases caused by soilborne pathogens of spinach．Phytopathology，82：403-406．

Larsson M．1994．Prevalence and pathogenicity of spinach root pathogens of the genus Pythium in Sweden．Plant Pathology，43：261-268．

Lodhi A M，Shahzad S，Ghaffar A．2004．Pythium deliense，a new record from Pakistan．Pakistan Journal of Botany，36（3）：673-676．

Meurs A．1934．Parasitic stemburn of deli tobacco．Phytopathology，7： 169-185．

Morita Y，Tojo M．2007．Modifications of PARP medium using fluazinam，miconazole and nystatin for detection of Pythium spp. in soil．Plant Disease，91：1591-1599．

Naiki T，Yasuhiro G，Kageyama K．1986．Pythium species causing damping-off of spinach seedlings under plastic-house cropping．Annals of the Phytopathological Society of Japan，52：772-778．

Parkunan V，Brenneman T P，Ji P．2014．First report of Pythium deliense associated with peanut pod rot in Georgia．Plant Disease，98：1269．

Sumner D R，Kays S J，Johnson A W．1976．Etiology and control of root diseases of spinach．Phytopathology，66：1267-1273．

Sumner D R．1991．Spinach（Spinacea oleracea L．）：common names for plant diseases．Plant Disease，75：225-230．

Teymoori S，Shahri M H，Rahnama K，Afzali H．2012．Identification and pathogenicity of Pythium species on cantaloupe in Khorasan Razavi province of Iran．Journal of Crop Protection，1（3）：239-247．

van der Plaats-Niterink A J．1981．Monograph of the genus Pythium．Studies in Mycology，21：1-242．

Waterhouse G M．1967．Key to Pythium pringsheim．Mycological Papers，109：1-15．

White T J，Bruns T，Lee S，Taylor J．1990．Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics//Innis M A，Gelfand D H，Sninsky J J，White T J，eds．PCR protocol：a guide of methods and application．San Diego：Academic Press：315-322．

Yamaguchi M．1983．World vegetables：principles，production，and nutritive values．Westport：AVI Publishing：1-415．

Zhou Y F，Shi Y X，Xie X W，Guo Y L，Li B J．2011．Leaf spot of spinach caused by Stemphylium spinaciae sp. nov．Mycosystema，30（3）：379-383．

Identif i cation of Spinach Damping-off Pathogens in Inner Mongolia Region

YIN Ling1，Koji Kageyama2，TIAN Xun1，LI Yi-wei1，JI Zhao-jun1，ZHAO Ru1
（1College of Life Science，Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao 028000，Inner Mongolia，China；2River Basin Research Center，Gifu University，Gifu 501-1193，Japan）

The samples of damping-off spinach seedlings were collected from the greenhouses in Tongliao，Baotou and Bayannur cities of Inner Mongolia．Pathogens were identified by morphological and molecular analysis，and pathogenicity tests of representative isolate of each species was carried out by seedlings infestation method．The result indicated that a total of 60 Pythium isolates were obtained from 82 plant samples．These isolates were identified as P. deliense，P. aphanidermatum and P. ultimum var. ultimum．Pathogenicity tests have proved that the Pythium species are pathogenic，causing damping-off，but with different disease severity．Among them P. deliense were the most pathogenic（infection rate 85.7%），the next was P. aphanidermatum （infection rate 42.9%），and the lowest was P. ultimum var. ultimum（infection rate 28.6%）．

Inner Mongolia；Spinach damping-off；Pythium；rDNA-ITS

銀玲，女，博士，副教授，專業方向：植物病原菌物分子生物學，E-mail：ginrei@163.com

2016-06-07；接受日期：2016-07-24

國家自然科學基金項目（31160353，31360574），通遼市與內蒙古民族大學科技合作項目（SXYB2012063）