草莓疫霉病病原菌鑒定

汪 泉 史芳芳

（新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆烏魯木齊 830088）

草莓疫霉病病原菌鑒定

汪 泉 史芳芳*

（新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆烏魯木齊 830088）

采集新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所草莓育苗網(wǎng)室內(nèi)典型疫霉病癥狀的發(fā)病草莓短縮莖，進(jìn)行組織培養(yǎng)、病原菌分離及純化，并進(jìn)行病原菌形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定。結(jié)果表明：發(fā)病草莓短縮莖分離得到的培養(yǎng)物在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)正反面無差異，分離純化獲得P1菌株；致病性結(jié)果表明，P1菌株在接種病原物的健康草莓短縮莖部位產(chǎn)生了病原菌菌絲；利用通用引物ITS1和ITS4對P1菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小約800 bp的條帶，獲得片段與Phytophthora cactorum strain GL1、BT1、TARI 20179菌株的ITS序列同源性均為100%；結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定致病病原菌為惡疫霉菌（Phytophthora cactorum）。

草莓；疫霉??；惡疫霉菌；病原菌鑒定

栽培草莓是薔薇科草莓屬八倍體植物，由于其漿果柔軟多汁、營養(yǎng)豐富，已成為世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物，目前我國草莓栽培面積約13.3萬hm2（200萬畝），居世界首位（花秀鳳，2012）。絕大多數(shù)草莓栽培品種易受惡疫霉的侵染，引起冠腐病、果實革腐病和紅中柱根腐病，給草莓生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失（張靜秋 等，2014）。疫霉菌是一群重要的植物病原菌，寄主范圍廣，可侵染茄果類、瓜類蔬菜及棉花、蘋果、梨、枸杞、草莓等作物，對寄主植物的破壞性強，危害性大（唐慶華 等，2011）。病原菌鑒定是病害有效防控的前提（張悅麗 等，2015），有關(guān)疫霉病的病原鑒定在豆類、瓜類、茄果類等作物上均有報道（羅蘭 等，2000），而對草莓疫霉病的鑒定報道多集中在草莓疫霉果腐病方面（Tsuchiya et al.，1986；羅蘭 等，2000），關(guān)于草莓疫霉莖腐病病原菌鑒定及防治鮮見報道。本試驗通過采集典型草莓疫霉病感病植株，對其短縮莖進(jìn)行病原菌分離純化、致病性鑒定、形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，旨在確定新疆地區(qū)草莓疫霉病病原菌，并為進(jìn)一步研究及防治提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

試驗于2016年1月在新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所草莓育苗網(wǎng)室進(jìn)行樣本采集，樣本為紅顏脫毒原原種苗具有典型癥狀的發(fā)病植株。用小鏟子從基質(zhì)槽中挖取帶有約10 cm基質(zhì)和根系的病株，將其放入自封袋中，4 ℃保存，做好標(biāo)記備用。

1.2 病原菌的分離純化

2016年3月在本所實驗室將短縮莖切去表皮層，流水沖洗30 min，晾干；用75%酒精消毒30 s，接著用無菌超純水沖洗3～5遍；再用10%次氯酸鈉溶液消毒8～10 min，無菌超純水沖洗3～5遍，用滅菌的無菌濾紙將短縮莖上的水吸干，之后切割成小薄片，接種于已滅菌的PDA平板上，每個平板中放3片短縮莖薄片，28 ℃下培養(yǎng)3～4 d。待組織邊緣部位有菌絲長出時，用接種環(huán)挑取單一菌絲轉(zhuǎn)接到PDA平板上繼續(xù)培養(yǎng)純化，純化3～4次后可以得到純的病原分離物。

1.3 致病性測定

2016年5月在本所溫室大棚里，將8株健康草莓幼苗種植在營養(yǎng)缽中，30 d后用無菌接種針在根、莖、葉部位分別扎一小洞，然后將另一無菌針沾取分離純化的病原菌接種到傷口處，接種后的植株保濕置于溫室中室溫條件下培養(yǎng)，以健康草莓植株為對照（不接菌），每處理2次重復(fù)，7 d后觀察接種病原物和對照組植株葉片、根、短縮莖感病狀態(tài)，持續(xù)觀察5 d。

1.4 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

將長滿病原物的PDA培養(yǎng)基平板置于4 ℃冰箱中，處理7 d后取出，室溫放置30 min。用無菌接種針挑取PDA平板上的少量菌絲，懸浮于滴加無菌水的載玻片上，先用光學(xué)顯微鏡的低倍鏡找到視野中的病原物，再用高倍鏡（10×20倍）觀察病原菌孢子形態(tài)。

參照鄭小波（1997）的方法從病原菌的菌株形態(tài)、菌絲、菌絲分枝、孢子及孢子囊等形態(tài)特征來進(jìn)行分類鑒定。

1.5 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

用PD液體培養(yǎng)基將純化得到的單一菌株在28 ℃下?lián)u菌振蕩培養(yǎng)5 d，將培養(yǎng)得到的菌球用鑷子取出置于研缽中，加液氮研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，提取DNA。DNA的提取使用百泰克普通植物基因提取試劑盒（離心柱型），利用卵菌核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）通用引物：ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對DNA上的ITS區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系（25 μL）：模板DNA 1 μL（約50 ng），2×PCR buffer mix（含Mg2+）12.5 μL，ITS1和ITS4引物（0.4 μmol·L-1）各1 μL，Taq DNA聚合酶（5 U·μL-1）0.4 μL，ddH2O 9.1 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性4 min；94 ℃ 變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行約40 min電泳，將擴(kuò)增出條帶的凝膠用小刀片切膠進(jìn)行回收，并送由上海生物工程有限公司測序。測序結(jié)果登陸GenBank進(jìn)行在線BLAST核酸同源性比對，并利用MEGA 5.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（參數(shù)bootstrap：1 000；gaps/missing data：pairwise deletion；model：No.of differences），以驗證形態(tài)學(xué)特征鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性及可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓疫霉病植株發(fā)病癥狀

疫霉病在草莓植株上的主要癥狀表現(xiàn)為：初期側(cè)枝萎蔫，心葉無變化，根及根莖內(nèi)部變褐色；地上部分呈矮化萎縮狀，葉柄變紅色，葉片變黃或萎蔫，逐漸發(fā)展為后期整株塌在基質(zhì)上，最終全株萎蔫枯死（圖1）。該病在定植后或初冬均可發(fā)生，被感染的植株呈矮化萎縮狀。

圖1 草莓疫霉病發(fā)病植株

2.2 分離菌株的致病性鑒定

通過對不同部位的致病性測定結(jié)果可知，對照植株無感病狀態(tài)，在接種病原物的健康草莓短縮莖部位產(chǎn)生了病原菌菌絲，而在根和葉部沒有發(fā)現(xiàn)感病特征。沾取感病植株短縮莖產(chǎn)生的病原菌菌絲置于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)重新培養(yǎng)的病原菌與原感病植株分離培養(yǎng)的惡疫霉菌（Phytophthora cactorum）菌落、菌絲、孢子囊、孢囊梗等形態(tài)相同；根據(jù)柯赫氏法則初步判斷該病原菌為草莓的致病菌，并且命名為P1。

2.3 分離菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

短縮莖分離得到的培養(yǎng)物在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，形態(tài)觀察正反面無差異，在PDA培養(yǎng)基上菌落均勻，短絨毛形，邊緣明顯（圖2），菌絲形態(tài)簡單，分枝較少，粗2.8～7.0 μm（圖3），未見菌絲膨大體。孢囊梗合軸分枝，直徑2.0～2.2μm。孢子囊頂生，近球形或卵形，罕為長卵形，基部圓形，大小（29.5～52.4）μm×（22.1～40.4）μm（圖4）；孢子囊具有明顯乳突，大部分為單乳突，乳突高6.1～7.0 μm（圖5）。鑒定結(jié)果表明，該病原菌的形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀基本符合惡疫霉菌Phytophthora cactorum（Stamps et al．，1990），故初步鑒定為P. cactorum（惡疫霉菌）。

圖2 短縮莖病原分離培養(yǎng)物

圖3 菌絲

圖4 孢子嚢形態(tài)

圖5 孢子嚢乳突

2.4 分離菌株的分子生物學(xué)鑒定

采用真菌ITS區(qū)域通用引物ITS1和ITS4對分離得到的菌株P(guān)1的ITS DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，獲得1條大小約800 bp的DNA片段（圖6）。對該片段進(jìn)行回收和測序，并在GenBank上進(jìn)行Blast分析，其序列包含P. cactorum真菌核糖體rDNA的部分18S rDNA序列；ITS1、5.5S rDNA、ITS4的全序列；部分28S rDNA的DNA片段，與P. cactorum strain GL1、BT1、TARI 20179菌株的ITS序列（登錄號分別為KT361202.1、KT361201.1、GU111587.1）同源性均為100%。再基于ITS基因進(jìn)行進(jìn)化分析，以鄰近的相關(guān)同源序列比較分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖7可知，P1與P. cactorum的3個菌株歸為一個分支，且其置信度為100%。因此，根據(jù)同源性和系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果將該病原菌鑒定為P. cactorum。

圖6 PCR擴(kuò)增結(jié)果M：DL2000；1：短縮莖分離得到的培養(yǎng)物。

圖7 基于ITS基因序列構(gòu)建的Phytophthora cactorum系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

隨著草莓栽培面積的擴(kuò)大和栽培方式的增加，出現(xiàn)了一系列病害問題，包括褐斑病、蛇眼病、枯萎病、根腐病、白粉病、灰霉病、炭疽病等，其中根腐病、枯萎病及炭疽病是草莓主要病害。草莓根腐病在世界各草莓種植區(qū)均有發(fā)生，主要為害根系，對產(chǎn)量的影響較大，但是不同地區(qū)病原菌種類存在較大差異，已經(jīng)報道的病原菌主要有立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、腐霉屬（Pythium spp.）、擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis sp.）、尖孢鐮刀菌草莓?；停‵usarium oxysporum f. sp. fragariae）和惡疫霉（Phytophthora cactorum）等（盛茹媛，2012）。近幾年國內(nèi)對引起草莓根腐病的疫霉菌的研究主要集中在疫霉果腐?。╢ruit rot）的鑒定（羅蘭 等，2000；薛德乾和吳勝楊，2005），疫霉紅心病（紅心根腐病）（red core root rot or red stele root rot）在中國的分布（張靜秋 等，2014），以及草莓與惡疫霉互作的分子機(jī)制（陳孝仁 等，2012）等方面。對草莓果腐病病原菌的形態(tài)、培養(yǎng)性狀、致病性及生理生化特性等方面的研究，確定了草莓果腐病病原菌為惡疫霉（羅蘭 等，2000）；而對草莓疫霉紅心病在中國的適生區(qū)進(jìn)行分析，為預(yù)防和控制該病害在中國擴(kuò)展蔓延提供了重要依據(jù)（張靜秋 等，2014）。本試驗從新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所草莓育苗網(wǎng)室中發(fā)生疫霉病病害的植株短縮莖中分離獲得了草莓疫霉病的病原菌，通過形態(tài)學(xué)和ITS基因DNA序列分析，確定該病病原菌為疫霉莖腐病惡疫霉菌（Phytophthora cactorum），屬于藻物界卵菌門卵菌綱腐霉目腐霉科疫霉屬（劉紫英 等，2008）。

疫霉是土傳病原菌，也產(chǎn)生休眠結(jié)構(gòu)（卵孢子），在土壤中能夠長期存活。疫霉病害的發(fā)生和危害度受土壤水分、溫度影響極大（代玉立，2011）。當(dāng)土壤水分飽和時，病原菌產(chǎn)生并釋放大量游動孢子，游動孢子通過土壤中充水的孔隙移動，并侵染草莓的根，冷涼至適中的溫度條件有利于侵染（張運濤和王桂霞，2015）。在溫度低濕度大的情況下易發(fā)病，6～10 ℃是發(fā)病適溫。根據(jù)發(fā)病原因調(diào)查，新疆地區(qū)發(fā)生此病害時處于1月，室外溫度低于-15 ℃，育苗溫室夜晚溫度在10 ℃以下，這與草莓惡疫霉菌的生長特性一致。

本試驗鑒定出的病原菌屬于疫霉菌，鑒于疫霉菌對苯酰菌胺類藥物敏感，筆者在生產(chǎn)中針對性地施用甲霜靈進(jìn)行防治，目前效果顯著，抑制住了病菌蔓延。

陳孝仁，張博月，May Bente Brurberg．2012．利用mRNA差異顯示技術(shù)克隆惡疫霉侵染誘導(dǎo)表達(dá)的草莓基因．南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，35（4）：54-58．

代玉立.2011.山東省大豆疫霉的鑒定及生物學(xué)特性探究〔碩士論文〕.合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué).

高智謀，鄭小波，陸家云．1999．惡疫霉生物學(xué)性狀的遺傳研究．安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，26（1）：50-53．

花秀鳳.2012.草莓種質(zhì)資源鑒定和種質(zhì)創(chuàng)新研究〔碩士論文〕.福州：福建農(nóng)林大學(xué).

劉紫英，康艷萍，袁斌．2008．草莓紅中柱根腐病病原菌的鑒定．植物保護(hù)，34（5）：163-165．

羅蘭，袁忠林，孟昭禮，徐春婷．2000．草莓果腐病病原疫霉種的鑒定．萊陽農(nóng)學(xué)院學(xué)報，17（1）：54-56．

盛茹媛．2012．草莓根腐病病原鑒定及分子檢測技術(shù)研究〔碩士論文〕．哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)．

唐慶華，宋薇薇，朱輝，牛曉慶，余鳳玉，韓超文，吳多揚，覃偉權(quán)．2011．我國熱區(qū)疫霉種的分布、疫病及其防治研究進(jìn)展．江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，23（8）：100-103．

薛德乾，吳勝楊．2005．草莓疫霉果腐病的發(fā)生與防治．當(dāng)代蔬菜，（4）：38．

張靜秋，王振華，龔國祥，婁少之，鄭作良，陳克．2014．基于MAXENT的草莓疫霉紅心病在中國的適生性分析．植物檢疫，28（3）：18-22．

張悅麗，張博，任鳳山，徐作珽，齊軍山，李長松．2015．草莓腐霉根腐病病原菌鑒定．植物保護(hù)學(xué)報，42（3）：477-478．

張運濤，王桂霞．2015．有機(jī)草莓主要土傳病害的栽培防治和生物防治//第七屆世界草莓大會系列譯文集-9（有機(jī)草莓生產(chǎn)手冊）．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社．

鄭小波．1997．疫霉菌及其研究技術(shù)．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社．

Stamps D J，Waterhouse G M，Newhook F J，Hall G S．1990．Revised tabular key to the species of Phytophthora．Mycology Pape，162．

Tsuchiya S，Yanagawa M，Ososhi A．1986．Formae speciales differentiation of Phytophthora vignae isolates from cowpea in adzuki bean．Annals of the Phytopathological Society of Japan，52：577-584．

Identif i cation of Pathogen Causing Strawberry Brown Phytophthora

WANG Quan，SHI Fang-fang*
（Agricultural Scientific Institute of the 12th Division of Xinjiang Production and Construction Corps，Urumchi 830088，Xinjiang，China）

The tissue of infected strawberry drawf stem collected in Agricultural Scientific Institute of the 12th Division of Xinjiang Production and Construction Corps was cultured，isolated，purified，and its pathogenicbacteria was identificated with morphological and molecular biology．The results showed that there was no difference in the morphology of the culture on the two-sided PDA medium．The P1 strain was gained by isolation and purification．The pathogenesis results showed that the isolated and purified strain could produce pathogen hyphaes in the dwarf stem of the health plant infected by pathogen．The DNA of P1 strain was amplificated by universal primers ITS1 and ITS4，and the band of 800 bp was obtained．The homology of fragment was 100% with the ITS sequence of Phytophthora cactorum strain GL1，BT1，TARI 20179 strain．The morphological and molecular biological identification showed that Phytophthora cactorum was the pathogen causing strawberry brown Phytophthora．

Strawberry；Phytophthora；Phytophthora cactorum；Pathogenic identification

汪泉，女，高級農(nóng)藝師，主要從事農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣工作，E-mail：499184842@qq.com

*通訊作者（Corresponding author）：史芳芳，助理研究員，主要從事生物技術(shù)研究，E-mail：451784039@qq.com

2016-07-25；接受日期：2016-09-25

國家星火計劃項目（2015GA891004），兵團(tuán)師域發(fā)展創(chuàng)新支持計劃項目