甘露聚糖結合凝集素對白假絲酵母菌相態轉化的影響及機制研究

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甘露聚糖結合凝集素對白假絲酵母菌相態轉化的影響及機制研究

宋家政1，高春海2

(1.蘭陵縣人民醫院，山東 蘭陵277799；2.臨沂市人民醫院 檢驗科)

白假絲酵母菌(Candidaalbicans，C.albicans)俗名白色念珠菌，是一種條件致病菌，廣泛存在于人的口腔、上呼吸道、皮膚、腸道及陰道黏膜，是一種正常菌群，但當機體免疫力低下或菌群失調時，C.albicans 即是一種條件致病菌，當發生感染時，C.albicans 就完成不同的菌相轉化，白假絲酵母菌就酵母相(Yeastform，Y)向菌絲相(Hyphalform，H)進行轉化，菌絲相酵母菌是造成感染的關鍵因素，有學者研究顯示菌相轉化與念珠菌感染之間存在明顯的相關性[1]，白假絲酵母菌菌相轉化需要一定的物理化學劑免疫調節分子的調節才能有效的完成轉化，相關物理化學條件研究較多，而對于免疫分子研究相對較少。

甘露聚糖結合凝集素(Mannan-bindinglectin，MBL)是一種存在于血漿中天然免疫調節因子，主要由肝細胞分泌[2]，近年來的報道顯示甘露聚糖結合凝集素對機體的免疫應答調節發揮著重要的作用[3-4]。本研究探討甘露聚糖結合凝集素(Mannan-bindinglectin，MBL)對白假絲酵母菌(Candida albicans，C.albicans)菌相態轉化的影響及相關調節機制。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

試驗所用試劑牛FITC、牛血清白蛋白、胰蛋白胨、瓊脂糖及胰蛋白酶均購自 Sigma公司，酵母提取物購自Gibco 公司，所用檢測儀器有流式細胞儀為美國 BD公司生產，倒置相差顯微鏡型號為TS100，為日本Nikon公司生產，核酸蛋白分析儀為德國Eppendorf公司生產。

1.2方法

1.2.1人甘露聚糖結合凝集素(Mannan-bindinglectin，MBL)的制備 具體操作步驟為1 mol/L CaCl2加入到新鮮冰凍人血漿1 000 ml，使其終濃度為20 mmol/L，37 ℃水浴2 h后4 ℃過夜，低溫離心機離心沉淀20 min，棄上清液取沉淀經過濾過、洗柱、超濾、離心等操作制備純化 MBL。

1.2.2C.albicans培養 采用常規方法將C.albicans 標準菌株置于酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養基中，28℃培養16 h后傳代1次，在RPMI1640培養基上將傳代培養物懸浮，濃度調整為5×107個/ml，行100 μl MBL(10 mg/L)處理的設為研究組，未行MBL處理的設為對照組，兩組均置于37℃200 r/min 條件下震蕩培養；間隔2 h觀察C.albicans 菌絲形成情況，剩余的菌懸浮液進行RNA提取。

1.2.3FITC-MBL的制備采用透析法制備FITC標記MBL，具體操作方法:將MBL置于pH9.6的碳酸鹽緩沖液進行透析過夜，用二甲基亞砜(DMSO)將FITC溶解并調節其濃度至1 mg/ml，根據比例在MBL蛋白溶液中滴入FITC-DMSO溶液，FITC/MBL=50 μg FITC/mgMBL，標記物中加入PBS溶液調節至2.5 mL，在室溫避光條件下用磁力攪拌器攪拌2 h，4℃透析過夜，MBL終濃度調節至10 mg/mL。

1.2.4C.albicans與FITC-MBL結合試驗將C.albicans置于Ca2+濃度分別為 1 mmol/L 、5 mmol/L的緩沖液或者EDTA液中，調整C.albicans菌液濃度為5×109個/L， 將濃度為10 mg/L的FITC-MBL加入到200 μl C.albicans菌液中， 并置于37℃培養箱避光培養半小時后用PBS 充分洗滌，未見FITC標記的MBL作為陰性對照組，各管加入200 μl流式洗液重懸細胞，流式細胞儀檢測。

1.2.5C.albicans HWP1、DDR 48mRNA的表達檢測首先提取C.albicans RNA，取研究組和對照組C.albicans 1×107個，根據Yeast RNAiso Kit 說明書提取RNA，用核酸蛋白分析儀測定提取的RNA的濃度及A260 nm/A280 nm 比值來判定RNA的純度及完整性，當260 nm/A280 nm>1.8時，說明提取的RNA的純度及完整性較高。根據情況將RNA的濃度調整為0.20 mg/ml。其次反轉錄合成cDNA，HWP1、DDR48 和β-actin引物合成是由公司合成(具體見表1)，分別提取的研究組和對照組C.albicans RNA 各1 μg，加入到反應體系中，使總反應體積在20 μL，首先37℃條件下，反應15 min合成 cDNA 第一鏈， 85℃條件下滅活反轉錄酶后終止反應，4℃條件下復性。最后PCR反應，反應體系中包括上、下游引物分別為0.8 μL，通過90℃條件下預變性 30 s，90℃條件下變性5 s，60℃條件下延伸30 s，并經過40次循環后進行瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后，紫外燈下觀察拍照，并用凝膠成像儀分析 DNA 片段的灰度值。

表1　RT-PCR基因引物序列及產物堿基數

1.3統計學分析

應用 SPSS17.0 軟件包進行統計處理， 數據采用單因素方差分析方法，P<0.05判定差異有統計學意義。

2結果

2.1兩組菌相轉化比較

從圖1中可以看出研究組經過MBL處理后2 h及4 h，C.albicans酵母相向菌絲相轉化明顯受到抑制，而在MBL處理8 h后，研究組菌絲生長速度與對照組基本一致。

2.2MBL抑制C.albicans菌相轉化的機制研究

本研究結合試驗結果顯示，無論是C.albicans的酵母相還是菌絲相，MBL 在不含緩沖液中均不能與C.albicans 結合，在濃度為5 mmol/L Ca2+的結合體系中，MBL與C.albicans 結合能力明顯高于在濃度為1 mmol/L Ca2+的結合體系中，說明MBL與C.albicans的結合與結合緩沖液中Ca2+濃度有明顯相關性。見圖2。

2.3MBL 對 C.albicans HWP1 、DDR48mRNA 表達的影響

從圖3中可以看出，研究組加入MBL后2 h、4h，PCR擴增產物顯示電泳帶相對較弱，而8 h時，電泳帶明顯增強，說明加入MBL后2 h、4 h，C.albicans HWP1 mRNA 表達明顯減少,而8 h時HWP1mRNA 表達增多，與對照組相比無明顯差異；而對于DDR48 mRNA的表達，在MBL處理的各個時間段，研究組和對照組DDR48 mRNA的表達無明顯差異；DNA片段灰度分析結果顯示，研究組加入MBL 處理后2 h、4 h，HWP1的灰度值與對照組相比明顯減弱，而在MBL 處理8 h時，HWP1的灰度值與對照組相比無明顯差異，DDR48灰度值在MBL處理后2 h、4 h及8 h與對照組相比無明顯變化，詳見表1。

圖1　倒置顯微鏡下觀察甘露聚糖結合凝集素抑制

圖2　MBL以Ca2+依賴的形式抑制C.albicans菌相轉化

組別HWP1(x1000)2h4h8hDDR48(x1000)2h4h8h研究組2.0±0.33.8±0.57.9±0.62.8±0.23.5±0.54.5±0.3對照組3.9±0.47.3±1.18.1±0.72.5±0.53.3±0.74.3±0.2P<0.05<0.05>0.05>0.05>0.05>0.05

圖3研究組和對照組C.albicans HWP1 、DDR48mRNA表達比較(+代表研究組，-代表對照組)

3討論

C.albicans 是一種致病真菌，在臨床上較為常見，常駐于人的口腔、上呼吸道、皮膚、腸道及陰道黏膜，是一種正常菌群，但當機體免疫力低下或菌群失調時，C.albicans 即是一種條件致病菌。C.albicans有兩種菌相，即酵母相和菌絲相，因此，又稱二態性真菌，正常條件下，酵母相真菌無感染性，而菌絲相真菌感染性相對較強，因此，白假絲酵母菌感染的關鍵環節是酵母相向菌絲相的轉化，在臨床工作中，有效的控制真菌感染的切入點就是阻斷酵母相向菌絲相轉化。

甘露聚糖結合凝集素是一種C.albicans 感染早期肝細胞合成分泌的急性期蛋白，正常無感染條件下，人血清濃度為0.01-10 mg/L， 在急性期感染條件下，甘露聚糖結合凝集素在外周血的水平急速增加[5]，因此，甘露聚糖結合凝集素在感染免疫調節機制中起著重要的作用，有學者研究顯示甘露聚糖結合凝集素對C.albicans 誘導的免疫反應有較強的抑制作用[6]。本研究結果顯示，研究組C.albicans經過MBL處理后2 h及4 h，C.albicans酵母相向菌絲相轉化明顯受到抑制，而在MBL處理8h后，研究組菌絲生長速度與對照組基本一致，說明在C.albicans 感染早期，加入 MBL處理能夠明顯抑制C.albicans 酵母相向菌絲相的轉化，達到抗感染的目的。而MBL是通過什么途徑抑制C.albicans 菌相轉化的，值得進一步探討，有學者[3]研究結果，Ca2+在C.albicans酵母相向菌絲相轉化的過程中起著重要的橋梁作用，本研究通過結合試驗結果顯示，無論是C.albicans的酵母相還是菌絲相，MBL 在不含緩沖液中均不能與C.albicans 結合，而隨著結合緩沖液中Ca2+濃度升高，MBL 與C.albicans 的結合呈增強趨勢，說明MBL與C.albicans的結合與結合緩沖液中Ca2+濃度有明顯相關性，可見白假絲酵母菌無論是酵母相還是菌絲相菌體表面可能存在依賴Ca2+的依賴MBL 結合受體。

HWP1 是一種基因，主要負責C.albicans 菌絲胞壁蛋白的編碼，有學者[7]研究顯示HWP1主要通過編碼甘露糖而與細胞壁的甘露糖以共價鍵的形式結合，從而促使C.albicans菌絲形成。本研究RT-PCR結果顯示研究組加入MBL后2 h、4 h，PCR擴增產物顯示電泳帶相對較弱，而8 h時，電泳帶明顯增強，說明加入MBL后2 h、4 h，C.albicans HWP1 mRNA 表達明顯減少，而8 h時HWP1mRNA 表達增多，與對照組相比無明顯差異；DNA片段灰度分析結果顯示，研究組加入MBL 處理后2 h、4 h，HWP1的灰度值與對照組相比明顯減弱，而在MBL 處理8 h時，HWP1的灰度值與對照組相比無明顯差異，說明甘露聚糖結合凝集素在早期能夠有效的抑制白假絲酵母菌菌絲生長，具體機制可能是與抑制HWP1 基因表達有關。

DDR48 蛋白是白假絲酵母菌形成菌絲和包膜的必需蛋白，有學者[8]研究顯示白假絲酵母菌形成菌絲和包膜的過程中DDR48 蛋白的表達量明顯增加，另外也是一種損傷反應的標志，與DNA損傷有關[9]。本研究結果顯示，在MBL處理的各個時間段，研究組和對照組DDR48 mRNA的表達無明顯差異；DNA片段灰度分析結果顯示，DDR48灰度值在MBL處理后2 h、4 h及8 h與對照組相比無明顯變化，說明甘露聚糖結合凝集素抑制酵母相向菌絲相轉化不是通過DDR48 基因介導的。

總之，甘露聚糖結合凝集素在C.albicans感染早期能夠依賴Ca2+抑制酵母相向菌絲相轉化，具體機制可能是通過減弱調控基因 HWP1 的表達。

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(收稿日期：2015-03-14)

作者簡介：宋家政(1966-)，男，山東蘭陵人，本科，副主任技師，主要研究方向：血液形態學、免疫學等。

文章編號：1007-4287(2016)03-0368-04