亞低溫治療對大鼠缺血再灌注損傷腦組織中Survivin和Bcl-2基因表達的影響

姜堯佳,徐振宇,王澤宇,劉永剛,魏春杰*,盛寶英

(1.佳木斯大學附屬第一醫院 神經內科，黑龍江 佳木斯154000；2.佳木斯大學基礎醫學院)

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亞低溫治療對大鼠缺血再灌注損傷腦組織中Survivin和Bcl-2基因表達的影響

姜堯佳1,徐振宇2,王澤宇1,劉永剛1,魏春杰1*,盛寶英1

(1.佳木斯大學附屬第一醫院 神經內科，黑龍江 佳木斯154000；2.佳木斯大學基礎醫學院)

摘要：目的觀察亞低溫治療對大鼠缺血再灌注損傷腦組織細胞中Survivin和Bcl-2基因表達的影響。方法90只wister大鼠制作大腦中動脈閉塞(MCAO)腦缺血再灌注損傷模型。隨機將大鼠分為假手術組，對照組(建模后常溫處理)和觀察組(建模后亞低溫處理)。將對照組和觀察組大鼠大腦中動脈缺血處理2，4，8小時，再灌注3 h，24 h，48 h，7 d，14 d后處死。亞低溫組于缺血20分鐘后亞低溫處理5小時。用免疫組織化學法檢測Survivin和Bcl-2在缺血再灌注損傷腦組織細胞中的表達情況。結果大鼠神經功能評分：假手術組(0.15±0.04)分，對照組(3.54±0.36)分，觀察組(3.72±0.55)分。亞低溫處理后Survivin和Bcl-2蛋白的表達增加。結論亞低溫治療后的大鼠腦缺血組織中的Survivin和Bcl-2蛋白表達增加，對大鼠的神經細胞有保護作用，改善大鼠再灌注治療的預后。

關鍵詞：亞低溫治療； Bcl-2； Survivin； 缺血再灌注損傷

(ChinJLabDiagn,2016,20:0352)

腦缺血會造成神經細胞的程序性死亡和壞死。亞低溫治療可以調控凋亡相關蛋白的表達，促進Survivin和Bcl-2蛋白的表達，抑制神經細胞的凋亡，減輕缺血再灌注對腦組織的損傷，促進損傷神經功能恢復。Benjamin發現亞低溫治療對大腦缺血再灌注損傷有治療作用[1]。本次研究著重探討亞低溫治療對 大鼠腦缺血再灌注損傷中Survivin和Bcl-2蛋白的表達影響。

1材料與方法

1.1材料佳木斯大學動物實驗中心提供的日齡為40 d的Wister大鼠90只，平均體重 (215±13)g。隨機分為假手術組，對照組(建模后常溫處理)和觀察組(建模后亞低溫處理)，每組各30只。

1.2方法

1.2.1建模方法用改良longa法建立大鼠大腦缺血再灌注模型：用1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，固定，消毒，備皮，分離左側頸總動脈，頸外動脈，頸內動脈和迷走神經。根部結扎頸內動脈；近心端結扎頸總動脈，頸總動脈遠端打一松扣，然后用動脈夾暫時夾閉。在靠近頸總動脈遠心端結扎處剪一V形小口，將魚線圓球端伸入頸總動脈，切口遠端用絲線結扎[2]。打開動脈夾，輕輕將圓球推入頸內動脈入顱方向，稍有阻力即停止。此時圓球端在大腦中動脈開口處，距離分叉處18 mm左右，將皮膚縫合，線殘端留于體外，并局部使用抗生素防止感染。再灌注時，將圓端拔出至頸總動脈開口結扎處，模擬缺血的腦組織的再灌注治療。假手術除不進行缺血處理外，操作與另外兩組相同。

1.2.2實驗方法觀察組在大腦缺血處理20 min后用冰袋對腦部進行亞低溫處理5 h，使腦組織溫度保持在32-33℃。對照組和觀察組在缺血4 h后，將各組大鼠隨機分為5個亞組，每個亞組6只，分別在對照組和觀察組再灌注3 h，24 h，48 h，1周，2周后處死。假手術組在上述五個時間點隨機選擇6只大鼠處死。

1.2.3造模成功評分[3]0分:無神經缺損癥狀；1分:對側前肢持續屈曲；2分:轉圈實驗陽性；3分:行走時向一側傾倒；4分:行走困難，意識障礙；5分：死亡。

1.2.4腦組織切片標本制作用1%戊巴比妥鈉將大鼠過度麻醉，4%多聚甲醛灌注后，斷頭取腦，在視交叉前后2 mm處做冠狀切片，將所取腦組織石蠟包埋，常規切片。

1.2.5Survivin和Bcl-2蛋白免疫組化檢測利用免疫組織化學法(S-P法)對切片標本中Survivin和Bcl-2蛋白的表達進行檢測。Survivin和Bcl-2蛋白一抗采用小鼠抗大鼠的Survivin和Bcl-2單克隆抗體，試劑盒購于SANTA CRUZ 公司。Survivin陽性和Bcl-2陽性細胞的胞漿胞核表達均呈棕黃色。每張切片在400倍鏡下取4個不重疊視野，每個視野計數100個細胞，對Survivin，Bcl-2蛋白陽性表達細胞進行計數，并計算平均值。

1.3統計學方法采用SPSS16.5軟件對所有實驗所得數據進行處理，對計數資料用χ2檢驗，對計量資料用t檢驗，P<0.05有顯著差異。

2結果

2.1各組大鼠神經功能評分大鼠死亡情況：假手術組0只，對照組17只，觀察組4只，假手術組(0.15±0.04)分，對照組(3.54±0.36)分，觀察組(3.72±0.55)分。

2.2Survivin和Bcl-2蛋白免疫組化結果假手術組極少表達(<1個)，故未計入，常溫缺血組及亞低溫缺血組Survivin和Bcl-2蛋白在神經元，少突膠質細胞，星形膠質細胞的胞漿中表達(P<0.01)。Survivin和Bcl-2蛋白的表達隨再灌注治療時間延長而增加，48 h時達到最大值，后呈下降趨勢，觀察組各時間點Survivin蛋白和Bcl-2蛋白陽性表達數均顯著高于對照組(P<0.01)。見表1和表2。

表1　Survivin蛋白陽性表達情況(個)

注：與對照組相比,*P<0.01

表2　Bcl-2蛋白陽性表達情況(個)

注：與對照組相比，*P<0.01

3討論

腦卒中的再灌注治療有狹窄的治療時間窗。因大腦是耗氧量最大的器官，短時間的缺氧即可造成腦細胞的變性，凋亡，壞死[4]。延長治療時間窗可以有效的改善腦卒中患者的預后。

亞低溫治療是使局部組織溫度在32-34℃[5]。研究表明亞低溫可以調控細胞的凋亡，降低大腦的耗氧量，調節腦血流，減少腦組織的炎癥反應，減少腦細胞的損傷，減輕缺血再灌注對腦組織的損傷，可以顯著延長治療時間窗。

凋亡抑制蛋白(IAP)是一種抑制細胞程序性死亡的細胞因子，它具有高度的遺傳保守性[6]。Bcl-2和Survivin蛋白是重要的抗細胞凋亡蛋白。提高Bcl-2和 Survivin在細胞中的表達可以有效的恢復神經細胞的功能，減少神經細胞的損傷。國外研究表明，亞低溫可以提高梗死灶中Bcl-2和Survivin 蛋白的表達。

Bcl-2家族基于機體保護機制在缺血早期表達增加，對神經元有抗缺血損傷作用，保護神經細胞[7]。隨著缺血時間延長，Bcl-2蛋白的表達減少，凋亡和壞死的神 經細胞增加，激活凋亡級聯反應，神經細胞損傷加重。Bcl-2蛋白通過減少細胞內鈣超載，抑制細胞凋亡信號通路的激活。本次實驗的觀察結果表明，亞低溫處理可以增加Bcl-2蛋白的表達，減少腦細胞的凋亡和壞死，有利于缺血再灌注后腦細胞的功能恢復。

Survivin蛋白也抑制細胞的凋亡。Edward等科學家發現在大鼠的大腦缺血再灌注模型中，Survivin蛋白會在缺血病灶和病灶周邊特異性的表達增加。 Survivin蛋白的表達增多由PKt / AKT 信號通路激活，有利于抑制神經細胞的凋亡，減輕缺血再灌注損傷[8]。本次實驗可觀察到，亞低溫可以誘導Survivin蛋白表達增多，減輕缺血再灌注對 神經細胞的損害。

實驗中，用亞低溫治療大鼠的生存率明顯提高，神經損害癥狀明顯減輕。說明亞低溫治療可以通過增加Bcl-2和Survivin 蛋白的表達，減少腦神經的凋亡。Lifei在研究中認為這可能與亞低溫選擇性的調控蛋白合成有關，具體機制有待進一步研究[9]。故亞低溫可以有效延長 腦缺血的有效治療時間窗，在臨床應用中可能改善腦卒中病人的預后，這與閆曉明的研究結果一致[10]。

從本研究結果中可以看出，亞低溫治療后的大鼠腦缺血組織中的Survivin和Bcl-2蛋白表達增加，對大鼠的神經細胞有保護作用，改善大鼠再灌注治療的預后。

參考文獻：

[1]Benjamin Bonneau,Julien Prudent,Nikolay Popgeorgiev,et al.Non-apoptotic roles of Bcl-2 family:The calcium connection[J].BBA-Molecular Cell Research,2013,183(37):1352.

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[3]Zhang Peng,Cheng Guo-Qiang.Research progress in mild hypothermia treatment of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy].[J].Chinese journal of contemporary pediatrics,2013,15(10):1390.

[4]杜立樹,平龍玉,張曼俐.缺血缺氧性腦病新生兒免疫功能的變化及臨床意義分析[J].中國實驗診斷學,2015,19(3):395.

[5]Liqun Wang,Yanyan Kang,Wenyun Zheng,et al.Effect on apoptosis and cell cycle of recombinant double negative dominant mutation Survivin (T34/117A) in breast cancer cell B-Cap-37[J].Biomedicine & Pharmacotherapy,2013,31(13):146.

[6]Min-Sung Lee,Ji-Hyang Ha,Ho Sup Yoon,et al.Structural basis for the conserved binding mechanism of MDM2-inhibiting peptides and anti-apoptotic Bcl-2 family proteins[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2014,15(1):1490.

[7]趙金川,趙燕,侯坤,等.聯合應用氯喹增加人膠質瘤細胞U343細胞對Bcl-2抑制劑ABT737的敏感性[J].中國實驗診斷學,2014,18(9):1402.

[8]Haidar Akl,Tamara Vervloessem,Santeri Kiviluoto,et al.Parys,Humbert De Smedt,Geert Bultynck.A dual role for the anti-apoptotic Bcl-2 protein in cancer:Mitochondria versus endoplasmic reticulum[J].BBA-Molecular Cell Research,2014,43(13):1880.

[9]Lifei Yu,Yuanfeng Zhou,Yi Wang.Effect of mild hypothermia on glutamate receptor expression after status epilepticus[J].Epilepsy Research,2012,10(1):148.

[10]閆曉明,劉慶波,羅毅男,等.亞低溫方法抗重度顱腦損傷作用的臨床研究[J].中國實驗診斷學,2003,7(6):534.

Effect of mild hypothermia on the expression of Survivin and Bcl-2 gene in brain tissue of rats with ischemia reperfusion injury

JIANGYao-jia，XUZhen-yu，WANGZe-yu，etal.

(DepartmentofNeurology,FirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity，Jiamusi154000,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of mild hypothermia therapy on regulation of cerebral ischemia reperfusion injury in rats and the expression of Survivin gene in Bcl-2 tissues and cells.MethodsRandomly selected 90 Wister rats are used for establish middle cerebral artery occlusion (MCAO) in cerebral ischemia reperfusion injury model.The rats were divided into sham operation group,control group (normothermic ischemia group) and observation group (mild hypothermia ischemia group).In the observation group and the control group of rats with middle cerebral artery ischemia treatment 2,4,8 hours,then reperfuse 3h,24h,48h,1 week,2 weeks.Mild hypothermia group reperfuse for 5 hours after ischemia mild hypothermia treatment for 20 minutes.Detection of Survivin and Bcl-2 cells by immune group content.ResultsThe score of neural function in rats:sham operation group is (0.15±0.04),control group is (3.54±0.36),the observation group (3.72±0.55) points.Comparison between groups with great difference.Mild hypothermia treatment increases the expression of Survivin and Bcl 2 gene.ConclusionThe expression of Survivin and Bcl-2 protein increased in tissue of rats after mild hypothermia treatment,and the treatment has a positive effect on rat neural cell,which can improve the prognosis of rats.

Key words:Mild hypothermia treatment;Bcl-2;Survivin;Ischemia reperfusion injury

(收稿日期：2015-06-27)

作者簡介：姜堯佳(1976-),男,內科主治醫師,醫學碩士,研究方向：缺血性腦血管病的防治。

文獻標識碼：A

中圖分類號：R364.1+2

文章編號：1007-4287(2016)03-0352-03

*通訊作者

基金項目：佳木斯大學科技項目(S2013-039)