硫酸吲哚酚對內皮祖細胞增殖的影響*

孟　華，陳　巖

鄭州大學人民醫院心血管內科 鄭州 450003

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硫酸吲哚酚對內皮祖細胞增殖的影響*

孟華，陳巖#

鄭州大學人民醫院心血管內科 鄭州 450003

關鍵詞內皮祖細胞；硫酸吲哚酚；細胞增殖；活性氧簇

摘要目的：觀察腎毒性物質硫酸吲哚酚對人內皮祖細胞(EPC)增殖的影響。方法：體外培養EPC，分別用0(對照)、25、50、100和200 mg/L硫酸吲哚酚刺激24、72、120 h后，MTT法測定細胞活性；分別用0(對照)、200 mg/L硫酸吲哚酚刺激24 h后，BrdU法測定細胞增殖率，流式細胞術測定活性氧(ROS)。結果：硫酸吲哚酚體外可呈劑量和時間依賴性地抑制EPC細胞活性。200 mg/L硫酸吲哚酚作用24 h, EPC增殖受抑(P<0.05)，同時細胞內ROS大量累積(P<0.05)。結論：硫酸吲哚酚可通過增加EPC細胞內ROS累積，抑制EPC增殖。

Effect of indoxyl sulfate on proliferation of endothelial progenitor cells

MENGHua，CHENYan

DepartmentofCardiology,People'sHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450003

Key wordsendothelial progenitor cell；indoxyl sulfate；cell proliferation；reactive oxygen species

AbstractAim: To investigate the effects of uremic solute indoxyl sulfate(IS) on the proliferation of endothelial progenitor cells(EPC).Methods: EPC were isolated from healthy donors, then cultured by 0(the control),25,50,100 and 200 mg/L IS for 24,72,and 120 h, and the viability was measured by MTT method. EPC were cultured by 0(the control) and 200 mg/L IS for 24 h, then the proliferation was detected by BrdU assay, and the reactive oxygen species(ROS) accumulation was examined by flow cytometry.Results: The viability of EPC was dose- and time-dependently inhibited by IS(P<0.05). The proliferation of EPC cultured by 200 mg/L IS for 24 h was inhibited with more ROS accumulation(P<0.05).Conclusion: IS could inhibit the proliferation of EPC via ROS.

心血管疾病是尿毒癥患者的首要致死因素[1]，尿毒癥溶質、不對稱精氨酸、活性氧簇(creactive oxygen species,ROS)等循環病理物質都可能在心血管病致病過程中起到重要作用[2]。很多尿毒癥患者體內存在惡化的血管內皮功能性障礙[3]，然而，有關尿毒癥溶質的病理學影響和致內皮功能障礙的機制仍不清楚。腎毒性物質導致細胞損傷的機制主要包括炎癥反應加劇、細胞凋亡和纖維化等。內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPC)是血管內皮細胞前體干細胞，在促進血管新生，促進受損血管恢復和缺血組織再血管化方面發揮了重要作用[4]。相關研究[5]結果顯示，循環EPC數量和功能隨著慢性腎功能不全的進展而下降，其可能受到腎毒性物質的影響。因此，作者對腎毒性物質硫酸吲哚酚對EPC增殖活性的影響及可能的分子機制進行了探討。

1材料與方法

1.1EPC的分離、培養和鑒定收集門診健康自愿捐獻者外周血20 mL，符合醫學倫理委員會要求，均簽署知情同意書。密度梯度離心法分離單個核細胞，按1×106mL-1接種于預包被人纖維粘連蛋白的6孔板中，細胞培養液為M199培養液[含有體積分數10%胎牛血清，EGM SingleQuot(Clonetics, Walkersville, USA)，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/L]。培養48 h后，更換培養液，去除未貼壁細胞。每2 d更換培養液。7～20 d后可見鋪路石樣細胞集落出現，采用細胞免疫熒光法進行鑒定：細胞培養至90%密度時，加入2.4 mg/L Dil標記的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL，Invitrogen公司)，37 ℃孵育1 h；多聚甲醛固定30 min, PBS漂洗3次； 加入10 mg/L FITC標記的荊豆凝集-1(FITC-UEA-1,Sigma公司)，37 ℃孵育1 h, PBS漂洗3次，熒光顯微鏡下觀察。

1.2硫酸吲哚酚對EPC活性影響的觀察收集對數生長期細胞，按照1×104mL-1接種于96孔板。參考慢性腎病患者血漿硫酸吲哚酚水平[6]， 分別用0(對照)、25、50、100和200 mg/L硫酸吲哚酚刺激24、72、120 h后，MTT法測細胞活性，酶聯免疫檢測儀測定490 nm波長處的吸光度(A)，每組設定3個復孔。細胞活性=(實驗組A-本底A)/(對照A-本底A)×100%。

1.3硫酸吲哚酚對EPC增殖能力影響的觀察收集對數生長期細胞，按1×104mL-1接種于96孔板中，細胞貼壁6 h， 用200 mg/L硫酸吲哚酚刺激24 h后去除上清；每孔加200 μL固定液室溫孵育30 min，去上清；加入100 μL BrdU抗體(Invitrogen)室溫孵育1 h，漂洗3次；加入100 μL二抗室溫孵育30 min，漂洗3次；加入底物100 μL，室溫孵育15 min；加入100 μL終止反應液孵育15 min；在酶聯免疫檢測儀450～540 nm波長處測量A，以測定值表示細胞增殖率。

1.4硫酸吲哚酚對ROS影響的觀察細胞培養至第3代，按1×105mL-1接種于6孔板中，加入200 mg/L硫酸吲哚酚刺激24 h，去除細胞培養液，使用溫浴(37 ℃)的HBSS輕輕沖洗細胞2遍，加入25 μmol/L的carboxy-H2DCFDA(Invitrogen)37 ℃避光孵育60 min，孵育結束前10 min加入Hoechst33342(1.0 μmol/L)，用溫浴(37 ℃)的HBSS沖洗細胞2遍，熒光顯微鏡下觀察，消化細胞，使用流式細胞術檢測細胞熒光強度，以此定量ROS的表達。

1.5統計學處理采用SPSS 16.0進行分析，EPC活性的比較采用4×3析因設計的方差分析，細胞增殖率和ROS含量的比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1EPC的分離及鑒定單個核細胞培養15～20 d后，可見鋪路石狀細胞集落形成并具有內皮細胞特征。熒光顯微鏡下可見,Dil-ac-LDL陽性(紅色熒光)及FITC-UEA-1陽性(綠色熒光)細胞，即為EPC(圖1)。

A:FITGUEA-1;B:Dil-ac-LDL;C:雙染。圖1　EPC熒光染色鑒定

2.2硫酸吲哚酚對EPC細胞活性的影響見表1。不同質量濃度硫酸吲哚酚刺激EPC相同時間后，細胞活性逐漸下降(P<0.05)；相同質量濃度硫酸吲哚酚刺激EPC 24、72、120 h后，細胞活性亦逐漸降低(P<0.05)。

2.3硫酸吲哚酚對EPC增殖和ROS含量的影響

見圖2、表2。200 mg/L硫酸吲哚酚刺激EPC 24 h后，細胞增殖率降低，ROS大量累積。

表1　各組EPC活性測定結果　%

F時間=11.341,F濃度=8.624,P均<0.001；F交互=0.766，P=0.404。

圖2　熒光顯微鏡下0(上排)和200(下排) mg/L硫酸吲哚酚組EPC中ROS的累積情況

組別n增殖率ROS含量0mg/L硫酸吲哚酚組33.35±0.1088±3200mg/L硫酸吲哚酚組31.83±0.04108±8t26.7314.054P<0.0010.015

3討論

心血管疾病是慢性腎功能不全患者的首要死因[7-8]。慢性腎病患者血管內皮功能紊亂，修復能力降低，與其循環EPC數量減少、功能減弱有著密切的關系[9]，并且循環EPC數量隨著腎毒性物質的蓄積而減少[10-11]。慢性腎病的許多毒性物質可能參與抑制EPC，對血管內皮功能造成損害，但是仍缺乏直接證據。硫酸吲哚酚是腸菌類異化色氨酸的代謝產物，其血清水平在慢性腎功能衰竭患者體內顯著增加，并且經血液透析去除量較少。已有研究[12]表明硫酸吲哚酚能夠抑制內皮增殖和體外傷口的恢復。硫酸吲哚酚可使人近端腎小管上皮細胞(HK-2細胞)發生氧化應激， 產生大量氧自由基產物，導致HK-2細胞損傷，加速細胞凋亡，加速腎功能減退[13]。腎小球系膜細胞的氧化還原狀態與有絲分裂原激活蛋白酶及細胞增生有關。硫酸吲哚酚的腎毒性還表現在破壞腎臟的抗氧化能力，它可促進腎小球系膜細胞內ROS的產生和降低超氧化物歧化酶(SOD)的表達,致使超氧化物清除能力降低，加速腎小球系膜細胞凋亡, 從而損傷腎小球[14]。該研究結果顯示硫酸吲哚酚體外可劑量和時間依賴性抑制EPC活性和增殖能力，增加EPC中ROS的累積，而ROS累積可能是硫酸吲哚酚影響EPC細胞活性的重要因素。

硫酸吲哚酚是透析后未能有效去除的蛋白結合尿毒癥溶劑，血液透析治療僅可去除30%，因此需要采用其他方案來去除這些尿毒癥溶劑。研究[15]顯示，口服吸附劑AST-120能夠降低患者體內硫酸吲哚水平。其他如縮減蛋白質消耗等方法也可以降低硫酸吲哚的血清水平。然而這些方案對尿毒癥患者的影響仍舊未知。該研究結果顯示，ROS累積可能是硫酸吲哚酚影響EPC細胞活性的重要因素，這必將為慢性腎功能不全并心血管疾病的治療提供新的思路。

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中圖分類號R543.2

#通信作者，男，1964年9月生，本科，主任醫師，研究方向：冠心病的診斷及治療，E-mail：hnsrmyycy@163.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.029

*河南省科技廳基礎與前沿技術研究計劃項目142300410264