非小細胞肺癌患者血漿miR-10b、miR-122、miR-16和miR-183水平及其與總生存期的關系

王富民，張寰，曲金力，錢碧云(天津醫科大學腫瘤醫院，天津00060； 2天津醫科大學研究生院；上海交通大學公共衛生學院)

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非小細胞肺癌患者血漿miR-10b、miR-122、miR-16和miR-183水平及其與總生存期的關系

王富民1，2，張寰1，曲金力1，錢碧云3(1天津醫科大學腫瘤醫院，天津300060； 2天津醫科大學研究生院；3上海交通大學公共衛生學院)

摘要：目的觀察非小細胞肺癌(NSCLC)患者血漿miR-10b、miR-122、miR-16、miR-183水平，并探討其與患者總生存期(OS)的關系。方法選擇NSCLC患者40例，其中術后復發32例、無復發8例。采用實時熒光定量PCR法檢測血漿miR-10b、miR-122、miR-16、miR-183。以各miRNA水平均數為界值，將NSCLC患者分為miRNA高水平和低水平，分析不同miRNA水平與患者OS的關系。結果無復發者血漿miR-183水平高于復發者(P<0.05)，其余miRNA水平二者比較P均>0.05。miR-183低水平者OS高于高水平者(P<0.05)，其余miRNA不同水平者OS比較P均>0.05。Cox比例風險回歸模型分析顯示，miR-183是NSCLC患者OS的獨立影響因素(HR=2.854，95% CI為1.154～7.055，P<0.05)。結論miR-183可能是NSCLC患者OS的獨立影響因素，而miR-10b、miR-122和miR-16與患者OS無關。

關鍵詞：非小細胞肺癌；微小核糖核酸；總生存期

微小核糖核酸(miRNA)是一種小的內源性非編碼單鏈小分子RNA。1993年第一個血漿miRNA被發現，目前已發現1 000多種miRNA。國外研究發現，血漿miRNA水平變化可能與腫瘤患者預后有關[1，2]。但目前國內關于血漿miRNA與腫瘤預后關系的報道較少。本研究選擇國外研究認為可能與腫瘤預后有關的4種miRNA，即miR-10b、miR-122、miR-16和miR-183，觀察其在不同預后非小細胞肺癌(NSCLC)患者血漿中的變化，并分析其與患者總生存期(OS)的關系。

1資料與方法

1.1臨床資料選擇2007年1月～2010年6月天津市腫瘤醫院收治的NSCLC患者40例，均行手術治療，術后經組織病理學檢查明確診斷。其中，男25例、女15例，年齡33～77(57±9)歲；組織類型：腺癌17例，鱗癌11例，其他12例；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期22例，Ⅲ、Ⅳ期18例。

1.2血漿miR-10b、miR-122、miR-16、miR-183檢測①標本采集及處理：所有研究對象取肘靜脈血10 mL，EDTA抗凝，室溫靜置30 min，4 ℃ 2 000 r/min離心20 min，收集血漿，-80 ℃冰箱凍存。②血漿RNA提取：加入1 mL TRIzol試劑并按試劑盒說明書提取RNA，采用微量紫外分光光度計進行紫外分光，總RNA A260/A280為1.48～1.62視為合格。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，稀釋至50 mg/L，-80 ℃保存。③cDNA合成：采用miRNA莖環結構特異性逆轉錄引物和miRNA逆轉錄試劑盒說明進行。探針序列(5′→3′)：miR-10b：UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG；miR-122：UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG；miR-16： UAGCAGCACGU-AAAUAUUGGCG；miR-183： UAUGGCACUGGUAGA-AUUCACU；cel-miR-39：UCACCGGGUGUAAAUCAG-CUUG。PCR總反應體系為15 μL，反應條件：16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min。cDNA樣本在-20 ℃保存。④miRNA水平檢測：采用Real-time PCR法。PCR反應體系為15 μL，反應條件：95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，共進行50個循環，降溫速度1.6 ℃/s。以cel-miR-39作為內參，以2-ΔΔCt計算miRNA相對水平，每樣本重復3次，取平均值。

1.3隨訪患者出院后定期隨訪，隨訪截至2012年12月，隨訪時間3～69個月、中位時間35個月，失訪1例。觀察復發情況，采用Kaplan-Meier生存分析法計算不同miRNA水平者的OS。

2結果

2.1NSCLC患者血漿miR-10b、miR-122、miR-16、miR-183水平觀察40例NSCLC患者血漿miR-10b、miR-122、miR-16、miR-183水平分別為5.30±0.32、5.46±0.46、5.54±0.61、5.34±0.76，以其均數為界值，高于或低于此界值為miRNA高水平或低水平。其中，miR-10b低水平21例、高水平19例，miR-122低水平16例、高水平24例，miR-16低水平17例、高水平23例，miR-183低水平21例、高水平19例。

2.2血漿miR-10b、miR-122、miR-16、miR-183水平與患者OS的關系40例NSCLC患者患者術后復發32例、無復發8例。無復發與復發者血漿miR-10b、miR-122、miR-16、miR-183水平比較見表1。miR-10b低水平及高水平者中位OS分別為53、34個月；miR-122低水平及高水平者中位OS分別為37、34個月；miR-16低水平及高水平者中位OS分別為54、34個月；miR-183低水平及高水平者中位OS分別為54、32個月。miR-183低水平與高水平者OS比較P<0.05；其余miRNA不同表達者OS比較P均>0.05。見插頁Ⅰ圖3。

表1　無復發與復發者血漿miR-10b、miR-122、

注：與無復發比較，*P<0.05。

以患者性別(男=0，女=1)、年齡(≤60歲=0，>60歲=1)、病理類型(肺腺癌=0，肺鱗癌=1，其他=2)、臨床分期(Ⅰ、Ⅱ期=0，Ⅲ、Ⅳ期=1)、復發(否=0，是=1)、miR-183表達(低水平=0，高水平=1)為自變量，OS為因變量，應用Cox比例風險回歸模型分析影響患者OS的因素。結果顯示，miR-183是NSCLC患者OS的獨立影響因素(HR=2.854，95%CI為1.154～7.055，P<0.05)。

3討論

NSCLC是臨床常見的惡性腫瘤，約占肺癌的80%[3]。目前，臨床尚無早期診斷NSCLC的特異標志物，多數患者就診時已處于中晚期，預后極差。因此，尋找NSCLC早期診斷的特異標志物具有重要意義。

miRNA可與靶基因信使RNA(mRNA)的3′端非翻譯區特異結合，抑制或降解mRNA的翻譯，進而調控靶基因。miRNAs可在外周血中穩定存在，不易被RNA酶降解。有研究發現，腫瘤患者miRNAs表達差異，并可將特異性miRNAs作為腫瘤的標記物[4～6]。有證據表明，miRNAs的表達有組織特異性，能反映腫瘤的轉移、復發等病理生理變化[7]。目前，在NSCLC中研究最多的生物標志物是Let-7a。有研究表明，NSCLC患者血清Let-7a水平顯著低于健康人群，其機制是通過抑制細胞周期相關蛋白、癌基因和周期蛋白D2的表達，促進腫瘤發生[8]。Dou等[9]研究發現，NSCLC患者血漿Let-7c、miR-152水平明顯下降，并與患者臨床病理參數相關，因此認為血漿Let-7c、miR-152水平檢測可作為一種無創的快速診斷NSCLC的方法。Li等[10]研究發現，miR-486和miR-150是NSCLC早期診斷的生物標志物。以上研究說明，血漿miRNAs水平變化可能對NSCLC的診斷和治療具有重要意義。

miR-183的主要功能是參與細胞生長、分化、凋亡等的調控[11]。有研究發現，腫瘤患者血漿miR-183水平并不一致，在結直腸癌、前列腺癌和肝細胞癌等高水平，在卵巢癌、乳腺癌和骨肉瘤等中低水平，但其不同水平均與患者預后有關[12～14]。miR-10b是一種致癌基因，其高水平可促進腫瘤細胞的增殖和侵襲[15]，與腫瘤患者預后不佳有關[16]。miR-122是一種腫瘤抑制基因，可抑制腫瘤的轉移和上皮-間充質轉化[17]，其低水平與腫瘤患者預后不佳相關[18]。miR-16位于DLEU2基因的內含子區域，其低水平亦能抑制腫瘤的遷移和侵襲[19]，是肺癌患者預后的獨立危險因素。本研究發現，無復發者血漿miR-183水平高于復發者，miR-183低水平者OS高于高水平者，提示miR-183是NSCLC患者OS的獨立影響因素。因此推測，miR-183是一種致癌基因，其高水平者預后較差。本研究無復發與復發者血漿miR-10b、miR-122和miR-16水平比較差異無統計學意義，且其水平與NSCLC患者OS無關。其原因可能與樣本量小有關，也可能與NSCLC不同發展階段miRNAs功能不完全一致有關。

綜上所述，miR-183可能是NSCLC患者OS的獨立影響因素，而miR-10b、miR-122和miR-16與患者OS無關。

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Plasma levels of miR-10b, miR-122, miR-16 and miR-183 in patients with non-small-cell lung cancer and their relationships with the overall survival

WANGFumin1,ZHANGHuan,QUJinli,QIANBiyun

(1TianjinMedicalUniversityCancerInstituteandHospital,Tianjin300060,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the levels of miR-10b, miR-122, miR-16 and miR-183 in patients with non-small-cell lung cancer (NSCLC) and to explore their relationships with the overall survival. MethodsAccording to recurrence, 40 NSCLC patients were divided into two groups: non-recurrence group (n=8) and recurrence group (n=32). The expression levels of 4 miRNAs were detected by real time quantitative PCR. NSCLC patients were divided into the high miRNA expression group and low expression group according to the mean value of miRNAs expression. Kaplan-Meier survival analysis and Cox regression were performed to determine the associations between different levels of miRNAs expression and overall survival (OS). ResultsThe expression of miR-183 was higher in the non-recurrence group as compared with that of the recurrence group (P<0.05). The OS of patients with low miR-183 expression level was higher than that with high miR-183 expression (P<0.05), and there was no significant difference in the OS of patients with different miRNA expression levels (all P>0.05). Cox proportional hazard regression showed that miR-183 was the independent risk factor for the overall survival of NSCLC patients (HR=2.854, 95% CI=1.154-7.055, P<0.05). ConclusionThe plasma level of miR-183 in patients with NSCLC is related to the overall survival, but plasma levels of miR-10b, miR-122 and miR-16 are not associated with the overall survival of patients.

Key words:non-small-cell lung cancer; microRNA; overall survival

(收稿日期：2015-12-03)

中圖分類號：R734.2

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)08-0017-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.08.006

通信作者簡介：錢碧云(1971-)，女，教授，主要研究方向為腫瘤分子與臨床流行病學。E-mail： qianbiyun@126.com

作者簡介：第一王富民(1988-)，男，碩士在讀，主要研究方向為腫瘤分子流行病學。E-mail： wangfumin57@163.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81573231)；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃(13JCYBJC23100)。