非酒精性脂肪肝大鼠肝組織FGF21 mRNA表達(dá)與脂質(zhì)沉積、胰島素抵抗的關(guān)系

申甜，徐碧林，盛霞，高月錦，汪紅平，喻明(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，上海200062)

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非酒精性脂肪肝大鼠肝組織FGF21 mRNA表達(dá)與脂質(zhì)沉積、胰島素抵抗的關(guān)系

申甜，徐碧林，盛霞，高月錦，汪紅平，喻明(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，上海200062)

摘要：目的觀察非酒精性脂肪肝(NAFLD)大鼠肝組織成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(FGF21)mRNA表達(dá)，并探討其與脂質(zhì)沉積、胰島素抵抗的關(guān)系。方法選擇SD大鼠40只，隨機(jī)分為對(duì)照組10只、高脂組30只。對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，高脂組給予高脂飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)8周，兩組均取10只，評(píng)價(jià)NAFLD模型建立情況。高脂組剩余大鼠繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)，分別于12、24周各取10只，腹主動(dòng)脈取血，檢測(cè)血清空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)、ALT、AST、TC、TG、FGF21、FFA水平，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)；處死大鼠取肝組織，制備石蠟切片，行HE染色，觀察肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；制備肝組織勻漿液，檢測(cè)TG含量；采用RT-PCR法檢測(cè)肝組織FGF21 mRNA表達(dá)。結(jié)果喂養(yǎng)8周時(shí)，高脂組體質(zhì)量、肝濕重及血清TG、TC水平均高于對(duì)照組(P均<0.05),肝組織呈大泡性脂肪變性并出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及點(diǎn)狀壞死，提示NAFLD模型建立成功。高脂組喂養(yǎng)12、24周時(shí)，血清FFA水平、肝組織TG含量、HOMA-IR明顯高于喂養(yǎng)8周時(shí)，且喂養(yǎng)24周時(shí)均高于喂養(yǎng)12周時(shí)(P均<0.05)；而血清FGF21水平、肝組織FGF21 mRNA表達(dá)則呈先升高再下降趨勢(shì)(P均<0.05)。結(jié)論NAFLD大鼠肝組織FGF21 mRNA表達(dá)、血清FGF21水平與肝組織TG含量有關(guān)，在NAFLD早期二者變化一致，胰島素抵抗可間接抑制其表達(dá)。

關(guān)鍵詞：非酒精性脂肪性肝病；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；脂質(zhì)沉積；胰島素抵抗；大鼠

非酒精性脂肪肝(NAFLD)與肥胖、高脂血癥、2型糖尿病等代謝紊亂密切相關(guān)，被認(rèn)為是胰島素抵抗(IR)在肝臟的表現(xiàn)，故早期發(fā)現(xiàn)NAFLD尤為重要。Li等[1]研究發(fā)現(xiàn)，血清成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(FGF21)水平與脂肪肝指數(shù)一樣，對(duì)NAFLD的早期診斷具有一定特異性。肝內(nèi)脂質(zhì)(TG)過(guò)度沉積是誘發(fā)NAFLD的啟動(dòng)因素，但血清FGF21水平與肝組織TG含量的關(guān)系目前尚未完全清楚；肝臟為血清FGF21的主要來(lái)源，血清FGF21水平是否與肝組織FGF21 mRNA表達(dá)一致鮮見(jiàn)報(bào)道。2014年4月~2015年4月，我們探討了NAFLD大鼠肝組織FGF21 mRNA表達(dá)及其與脂質(zhì)沉積、胰島素抵抗的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1材料清潔級(jí)、雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(180±10)g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK(冀)2008-1-003。所有大鼠分籠喂養(yǎng)，動(dòng)物房?jī)?nèi)通風(fēng)良好，室溫18～25 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，光照時(shí)間每天12 h。胰島素試劑盒，上海博谷生物科技有限公司；FGF21酶聯(lián)免疫試劑盒，南京建成生物工程研究所；PrimeScriptTMRT和SYBR?Premix Ex TaqTM，日本TaKaRa Bio株式會(huì)社。

1.2動(dòng)物分組及NAFLD模型建立大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)將SD大鼠分為對(duì)照組10只和高脂組30只。高脂組參照文獻(xiàn)[2]建立營(yíng)養(yǎng)性NAFLD模型：高脂飼料(基礎(chǔ)飼料83%、豬油10%、蔗糖5%、膽固醇1.5%、膽鹽0.5%)；對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料(含蛋白質(zhì)21%、脂肪6%、碳水化合物55%)喂養(yǎng)。喂養(yǎng)8周，對(duì)照組及高脂組各取10只，稱體質(zhì)量；腹主動(dòng)脈取血，分離血清，采用AU2700型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)空腹血糖(FPG)、ALT、AST、TC、TG，ELISA法檢測(cè)空腹胰島素(FINS)，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)[3]。處死大鼠，取出肝臟，稱濕重，計(jì)算肝臟指數(shù)(肝臟濕重/體質(zhì)量)。取最大葉肝臟用10%中性甲醛固定，HE染色，參照文獻(xiàn)[4，5]觀察肝細(xì)胞脂肪變性程度。綜上評(píng)價(jià)高脂組NAFLD模型建立情況。高脂組剩余大鼠繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)，喂養(yǎng)12、24周時(shí)各取10只，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.3相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1血清FGF21、FFA水平高脂組分別于喂養(yǎng)8、12、24周，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，采用AU2700型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)FPG，ELISA法檢測(cè)血清FINS、FGF21、FFA，并計(jì)算HOMA-IR。

1.3.2肝組織TG含量取血后處死，取適量肝組織，放入玻璃勻漿管中，加入3倍體積甲醇，1 500 r/min勻漿5 min；然后倒入具塞離心管中，加入6倍體積氯仿，漩渦混合器混勻，制備10%組織勻漿。將勻漿分別抽提6、12、24 h，小心抽取下層有機(jī)溶劑層10 μL置于1 mL工作液中，37 ℃分別孵育10、15、20 min，6 000 r/min離心10 min。根據(jù)TG試劑盒測(cè)定肝組織TG含量。

1.3.3肝組織FGF21 mRNA表達(dá)采用RT-PCR法。TRIzol法抽提大鼠肝組織總RNA，紫外分光光度計(jì)和電泳檢測(cè)RNA純度、濃度及完整性，并計(jì)算RNA含量。RNA含量(μg/μL)=稀釋倍數(shù)×OD260值×40/1 000。按Superscript Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。引物設(shè)計(jì)和合成：FGF21基因序列均從GenBank中獲取，引物用Primer5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)。FGF21上游引物：5′-GTGCGAGGCAT-

ACCCCATC-3′，下游引物：5′-CCGTCCTCCCTGATCT-CCA-3′；GAPDH上游引物：5′-CTCATGACCACAGT-CCATGC-3′，下游引物：5′-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系20 μL：Premix Ex Taq (2 X)10 μL，PCR Forward Primer (10 μmol/L)0.5 μL，PCR Reverse Primer (10 μmol/L)0.5 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)結(jié)束，ABI7300 SDS Software自動(dòng)分析熒光信號(hào)并將其轉(zhuǎn)換為Ct值。Ct值取3個(gè)復(fù)管的平均值。ΔCt為目的基因Ct值與內(nèi)參Ct值的差值。以2-ΔΔCt作為肝組織FGF21 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1NAFLD模型建立情況喂養(yǎng)8周，高脂組體質(zhì)量較對(duì)照組明顯增加(P<0.05)；血生化指標(biāo)(FINS、ALT、AST、TC、TG)及HOMA-IR較對(duì)照組明顯升高(P均<0.05)；大鼠處死后，肝臟濕質(zhì)量較對(duì)照組亦明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)表1、2。肝組織病理觀察：肉眼觀察，對(duì)照組肝臟形態(tài)正常，高脂組肝臟外形稍飽滿、圓鈍，色紅，質(zhì)地較脆；光鏡下觀察，對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，輪廓清晰，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝小葉中細(xì)胞分界清晰，胞核圓，位于細(xì)胞中央，胞質(zhì)豐富，未見(jiàn)肝細(xì)胞脂肪變性或壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；高脂組肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，肝索放射狀排列不明顯，大部分細(xì)胞腫脹，胞核消失或被脂肪空泡。以上結(jié)果證實(shí)，NAFLD模型建立成功。

表1　兩組體質(zhì)量、肝臟濕質(zhì)量及肝臟指數(shù)比較±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

表2　兩組血生化指標(biāo)及HOMA-IR比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.2高脂組不同喂養(yǎng)時(shí)間血清FGF21、FFA水平及肝組織TG含量、肝組織FGF21 mRNA表達(dá)、HOMA-IR比較見(jiàn)表3。

3討論

NAFLD是以肝臟酶學(xué)指標(biāo)升高、脂肪浸潤(rùn)為主要表現(xiàn)的代謝性疾病，而肝內(nèi)脂質(zhì)過(guò)度沉積與IR密切相關(guān)[6～8]。幾乎所有NAFLD患者既存在外周IR又存在肝臟IR，肝臟病變程度與IR水平有一定相關(guān)性[9，10]。FGF21屬于FGF家族成員，人類FGF21基因位于第19號(hào)染色體中，由209個(gè)氨基酸編碼而成。FGF21主要由肝組織、脂肪組織和胰腺分泌，具有內(nèi)源性調(diào)節(jié)糖脂代謝及胰島素分泌作用；FGF21主要表達(dá)于肝臟，在骨骼肌、胰腺β細(xì)胞和脂肪組織也有少量表達(dá)。以往研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者血清FGF21水平明顯升高[11～13]；Yan等[14]研究證實(shí)，血清FGF21水平是反映NAFLD患者肝臟脂肪含量的生物學(xué)指標(biāo)，其水平與肝臟脂肪含量呈正相關(guān)。Bobbert等[15]研究認(rèn)為， FGF21是代謝綜合征和2型糖尿病的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。上述研究證實(shí)，血清FGF21水平在肝臟脂肪含量變化、肝臟脂肪變性及糖代謝異常中扮演重要角色。然而，臨床上無(wú)法探索不同程度肝臟脂質(zhì)沉積與血清FGF21水平的關(guān)系；同時(shí)，肝臟作為血清FGF21水平的主要來(lái)源，肝組織mRNA變化是否與血清FGF21水平一致，相關(guān)報(bào)道較少。本研究采用連續(xù)單純性高脂喂養(yǎng)建立營(yíng)養(yǎng)性NAFLD模型，于喂養(yǎng)8周觀察高脂組體質(zhì)量、肝臟濕質(zhì)量增加，血清FFA、FPG、FINS水平和HOMA-IR明顯升高，均高于對(duì)照組；肝組織病理表現(xiàn)為大部分細(xì)胞腫脹，胞核消失，伴ALT增高，出現(xiàn)內(nèi)臟型肥胖和IR，提示大鼠NAFLD模型建立成功。喂養(yǎng)12～24周，高脂組肝組織TG含量增加，血清FFA水平迅速升高，IR程度逐漸加重。

表3　高脂組不同喂養(yǎng)時(shí)間血清FGF21、FFA水平及肝組織TG含量、FGF21 mRNA表達(dá)、HOMA-IR比較

注：與喂養(yǎng)8周比較，#P<0.05；與喂養(yǎng)12周比較，△P<0.05。

早期代償性高胰島素血癥可使肝臟增多的FFA大量轉(zhuǎn)變?yōu)門(mén)G，進(jìn)一步發(fā)展時(shí)，由于肝細(xì)胞損傷和載脂蛋白B合成相對(duì)減少，大量TG無(wú)法從肝臟內(nèi)運(yùn)出，而在肝細(xì)胞內(nèi)大量沉積，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性。本研究結(jié)果顯示，高脂組喂養(yǎng)8～24周，肝組織TG含量增加且出現(xiàn)IR，血清FGF21水平及肝組織FGF21 mRNA表達(dá)量相應(yīng)升高，二者變化呈一致性，而FPG無(wú)明顯升高；喂養(yǎng)12～24周，IR雖逐漸加重，但血清FGF21水平、肝組織FGF21 mRNA表達(dá)卻相應(yīng)下降。其水平下降的原因可能是機(jī)體在病理?xiàng)l件下為提高FFA的氧化和葡萄糖利用，抵消其在組織內(nèi)糖脂毒性的一種表現(xiàn)，但需要進(jìn)一步研究證實(shí)。鑒于NAFLD演變至非酒精性脂肪性肝炎過(guò)程中肝組織FGF21 mRNA異常表達(dá)及血清FGF21水平與肝組織TG含量及IR之間的特殊關(guān)系，推測(cè)早期血清FGF21水平變化為保護(hù)性，而后期受外周IR的相對(duì)抑制，今后需進(jìn)一步研究加以證實(shí)。本研究還發(fā)現(xiàn)，血清FGF21水平與肝組織FGF21 mRNA變化呈一致性，且脂肪肝早期FGF21 mRNA與肝臟TG含量呈正相關(guān)，故認(rèn)為血清FGF21水平可作為NAFLD早期診斷的血清標(biāo)記物。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21為一種防御糖脂代謝紊亂的保護(hù)因子[16～18]，對(duì)糖尿病及肥胖有潛在治療作用。但在某些病理?xiàng)l件下，血清FGF21水平升高的原因及機(jī)制，可用FGF21抵抗的概念來(lái)解釋，即類似于高瘦素血癥和高胰島素血癥，但仍需進(jìn)一步研究。

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Correlations of FGF21 mRNA expression with fat deposition and insulin resistance in rat liver with NAFLD

SHENTian,XUBilin,SHENGXia,GAOYuejin,WANGHongping,YUMing

(ShanghaiPutuoDistrictCentralHospital,Shanghai200062,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the fibroblast growth factor 21 (FGF21) mRNA expression level in rat liver with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and to investigate its relationship with fat deposition and insulin resistance. MethodsForty SD male rats were randomly divided into the control group (n=10, NC group) fed with basic food and high-fat group (n=30, HF group) fed with high-fat diet. After 8-week feeding, 10 rats were selected to observe whether the NAFLD models were built successfully in the HF group. After that the rest of rats in the HF group were fed with high-fat diet, and at week 12, 10 rats were selected and at week 24, the other 10 were selected. The fasting blood-glucose (FPG), fasting insulin (FINS), alanine transamianse (ALT), aspartate transamianse (AST), total cholesterol (TC), triglyceride (TG), serum FGF21, serum FFA, and homeostasis model assessment of insulin resistance (HOMA-IR) were calculated. The pathological change of liver was observed by HE staining; liver triglyceride (TG) content was tested and the expression of FGF21 mRNA in liver was detected by RT-PCR. ResultsAt the 8 th week, the body mass, liver-wet weight, serum TG and TC of the HF group were higher than those of the NC group (all P<0.05), liver tissues of the HF group changed to bullous steatosis and had inflammatory cell infiltration and spotty necrosis, so that NAFLD model was built successfully. In the end of 12 and 24th weeks, the serum FFA, TG content and HOMA-IR were significantly higher than those of the 8th week, and the 24th week was also higher than the 12th week (all P<0.05). During the week 8-12, the serum FGF21 and expression of FGF21 mRNA in liver of the HF group increased first and then decreased (all P<0.05). ConclusionThe expression of FGF21 mRNA in liver and serum FGF21 of NAFLD rats were related with the liver TG content. Besides, both of them have the same change in the early stage of NAFLD, and insulin resistance may inhibit the expression of FGF21mRNA indirectly.

Key words:non-alcoholic fatty liver disease; fibroblast growth factors; lipidoses; insulin resistance; rat

(收稿日期：2015-06-30)

中圖分類號(hào)：R575.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)08-0010-04

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.08.004

通信作者簡(jiǎn)介：喻明(1956-)，男，主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)樘悄虿〉脑\斷及治療。E-mail： mgyu403@aliyun.com

作者簡(jiǎn)介：第一申甜(1980-)，女，主治醫(yī)師，主要研究方向?yàn)榉逝旨耙葝u素抵抗。E-mail： shentian2017@163.com

基金項(xiàng)目：上海市衛(wèi)生局青年科研項(xiàng)目(2013Y079)；上海市中醫(yī)藥大學(xué)后備業(yè)務(wù)專家培養(yǎng)計(jì)劃。