NF-κB反義RNA基因在超聲聯合微泡作用下對類風濕性關節炎大鼠血清TNF-α、IL-1β水平的影響

劉 潔，景香香，楊炳昂，符少清，王東林，吳湯娜

（海南省人民醫院，海南 海口 570311）

NF-κB反義RNA基因在超聲聯合微泡作用下對類風濕性關節炎大鼠血清TNF-α、IL-1β水平的影響

劉 潔，景香香，楊炳昂，符少清，王東林，吳湯娜

（海南省人民醫院，海南 ?？?570311）

目的：觀察NF-κB反義RNA基因在超聲聯合微泡作用下對類風濕性關節炎（Rheumatoid arthritis，RA）大鼠血清TNF-α、IL-1β水平的影響，探討其對RA治療的可行性。材料與方法：采用層-層吸附法將NF-κB反義RNA基因和多聚賴氨酸（Polylysine，PLL）分層吸附在自制的脂質超聲微泡造影劑上，制備成載（PLL+DNA+PLL+DNA）的微泡。60只正常清潔級Wister雌性大鼠，分為6組（其中B～F組為造模成功后的RA大鼠），每組10只（20個膝關節）。A組：正常對照組；B組：RA大鼠模型對照組；C組：單純NF-κB反義RNA基因組；D組：超聲+NF-κB反義RNA基因組；E組：微泡+NF-κB反義RNA基因組；F組：超聲+微泡+NF-κB反義RNA基因組。ELISA檢測比較各組大鼠血清中的細胞因子TNF-α和IL-1β水平變化。結果：模型對照組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平明顯高于正常大鼠組（P＜0.01），單純基因組、超聲+基因組、微泡+基因組、超聲+微泡+基因組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平均低于模型對照組（P＜0.05，P＜0.01），單純基因組、超聲+基因組、微泡+基因組3組之間比較無顯著性差異（P＞0.05），超聲+微泡+基因組與單純基因組、超聲+基因組、微泡+基因組比較有顯著性差異（P＜0.05）。結論：NF-κB反義RNA基因在超聲聯合微泡作用下對RA大鼠血清TNF-α、IL-1β水平有明顯的下調作用，有助于提高RA的治療效果。

關節炎，類風濕；白細胞介素1；腫瘤壞死因子α；超聲檢查，介入性

超聲擊破微泡造影劑介導基因轉染的方法，具有安全、高效和靶向性好的優點，近年來已經在心臟、腦、角膜及腫瘤組織中得到實驗證實[1-3]。本研究旨在觀察該方法介導NF-κB反義RNA基因對類風濕性關節炎（Rheumatoid arthritis，RA）大鼠動物模型的治療可行性，并通過觀察RA大鼠血清中細胞因子TNF-α和IL-1β水平變化評價其治療效果。

1 材料與方法

1.1 RA大鼠動物模型制備

60只正常清潔級 Wister雌性大鼠，體質量258～279 g，平均（261.57±5.42）g。福氏完全佐劑按4 mg/mL加入滅活的卡介苗，4℃保存備用。將Ⅱ型膠原溶解于0.01mol/L的乙酸中，使終濃度為4mg/mL，4℃攪拌過夜。將攪拌好的Ⅱ型膠原乙酸溶液按1∶1滴加至冷的福氏完全佐劑中，充分乳化。每只大鼠在左后足底、尾根部、背部分3點皮內注射乳化液共0.25mL，7 d后用同樣方法加強注射1次。大鼠四肢足爪均嚴重腫脹、踝關節直徑增長幅度≥2 mm為造模成功。

1.2 載基因微泡的制備

采用層-層吸附法將NF-κB反義RNA基因和多聚賴氨酸（Polylysine，PLL）分層吸附在自制的脂質超聲微泡造影劑上，制備成載 （PLL+DNA+PLL+ DNA）的微泡（重慶醫科大學超聲影像學研究所饋贈）。

1.3 實驗動物分組

實驗動物隨機分為6組，1組為正常大鼠，5組均為RA大鼠模型，每組10只（20個膝關節）。A組：正常對照組；B組：模型對照組；C組：單純NF-κB反義RNA基因組；D組：超聲+NF-κB反義RNA基因組；E組：微泡+NF-κB反義RNA基因組；F組：超聲+微泡+NF-κB反義RNA基因組。

1.4 基因轉染方法

C組：單純向大鼠關節腔內注射10 μg NF-κB反義RNA基因和300 μL生理鹽水；D組：先將10 μg NF-κB反義RNA基因和300 μL生理鹽水注射入大鼠關節腔內，再采用超聲持續輻照10 min；E組：市售SonoVue（意大利Bracco公司）凍干粉一支，用5mL生理鹽水（0.9%NaCl）稀釋后，取300μL與10μg NF-κB反義RNA基因混合之后，4℃靜置30 min，注射入大鼠關節腔內；F組：稀釋后的SonoVue 300μL與10 μg NF-κB反義RNA基因混合，注射入大鼠關節腔內之后，再用超聲（Philips HDI 4000）持續輻照10min。超聲輻照條件已經在以前的實驗中優化，探頭頻率10MHz，機械指數（MI）1.3，深度2cm。所有實驗過程均保持儀器設置一致。

1.5 大鼠血清TNF-α及IL-1β水平檢測

各組大鼠在治療后30 d，股動脈采血，提取分離上清，按照TNF-α和IL-1β檢測試劑盒的說明，采用ELISA方法檢測大鼠血清TNF-α、IL-1β的水平。

1.6 統計學方法

本研究數據處理使用SPSS 13.0進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，本組數據資料經檢驗服從正態分布，組間比較采用方差分析（SNK法），P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

大鼠RA動物模型：每只大鼠在左后足底、尾根部、背部分3點皮內注射乳化液，7 d后加強注射1次，14 d后大鼠四肢足爪均嚴重腫脹、踝關節直徑增長幅度≥2 mm，并經病理切片證實成功建立RA模型（圖1）。

各組大鼠血清TNF-α及IL-1β水平檢測結果見表1。

表1 各組大鼠血清TNF-α及IL-1β水平的比較（±s）

表1 各組大鼠血清TNF-α及IL-1β水平的比較（±s）

注：與正常對照組比較，1：P＜0.01。與模型對照組比較，2：P＜0.05，3：P＜0.01。單純基因組、超聲+基因組、微泡+基因組3組之間比較，4：P＞0.05。超聲+微泡+基因組與單純基因組、超聲+基因組、微泡+基因組比較，5：P＜0.05。

組別 膝關節數（n） TNF-α（ng/L） IL-1β（ng/L）正常對照組 10 32.68±9.23 2.45±0.24模型對照組 10 90.12±16.14110.10±2.011單純基因組 10 72.12±10.272，47.57±1.482，4超聲+基因組 10 69.28±11.852，46.98±1.872，4微泡+基因組 10 70.64±15.292，48.10±1.292，4超聲+微泡+基因組 10 51.29±11.833，54.69±0.973，5

圖1 大鼠RA動物模型。圖1a：正常大鼠關節，病理切片可見滑膜細胞基本呈單層整齊排列（HE）。圖1b：RA大鼠關節明顯腫脹，病理切片可見滑膜細胞明顯增生，排列紊亂，毛細血管明顯擴張充血（HE）。Figure 1.Rat model of RA.Figure 1a:Normal rat joints.The pathology slice shows that synovial cells are arranged regularly in a monolayer(HE).Figure 1b:Joints of RA rats are significantly swollen.Pathology slice shows significant proliferation and disorganization of synovial cells.Capillaries are significantly dilated and congested(HE).

3 討論

RA是關節疾病中最常見的一種以慢性炎癥、異常免疫反應和滑液增多為特征的全身性自身免疫性疾病。到目前為止，RA的發病機制不十分清楚，因此尚無滿意的治療方法。國內外研究表明，基因治療在RA疾病方面顯示出了較好的前景[4-6]。

多數學者認為RA的啟動是通過提呈抗原給CD4+淋巴細胞，兩者相互作用從而激活了淋巴細胞?；罨牧馨图毎碳魏?巨噬細胞釋放單核因子，特別是TNF-α和IL-1β。這些單核因子是主要的前炎癥細胞因子，對關節實質細胞和內皮細胞具有廣泛的作用，在形成RA炎癥、新生血管生成和骨質破壞中起著重要的作用。RA病人血液和滑液中存在大量TNF-α，滑膜組織中巨噬細胞和內皮細胞能表達抗原性TNF-α。動物實驗表明，小鼠轉入TNF-α基因，可持續表達TNF-α，自發產生類似RA的關節炎，抗TNF-αmAb能減輕TNF-α轉基因小鼠以及膠原誘導的關節炎模型小鼠的炎癥。在RA中，IL-1β是最強的骨吸收劑，尤其局部IL-1β的水平抑制軟骨修復的作用與TNF-α協同增強且較TNF-α更為重要；IL-1β可通過上調核因子NF-κB配基的受體激活劑活性，直接增強破骨細胞骨侵蝕吸收能力，導致骨的破壞，同時抑制Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的合成，抑制軟骨細胞的修復重建，最終引起關節軟骨、骨的損傷；IL-1β也可作用于成骨細胞，誘導NF-κB配基的受體激活劑的表達，它可刺激破骨細胞前體分化為成熟的破骨細胞，并進一步使其活化，加速骨侵蝕。由此可見，TNF-α和IL-1β在RA的發生和進展中起著決定性作用。

核轉錄因子是一類蛋白質，具有和某些基因上啟動子區的固定核苷酸序列結合而啟動基因轉錄的功能。自1986年被發現以來，許多以NF-κB為作用靶點治療或緩解疾病的研究已相繼報道。在這些研究中，NF-κB與RA的相關研究成為熱點之一，其已被證實在成人RA發病中起關鍵作用。在免疫介導的RA的炎癥、增生和骨侵蝕三大病理過程中，NF-κB都起著中心調節作用。以NF-κB為靶點，針對其信號通路中的各個環節抑制其活化，目前已成為抗炎、抗風濕治療研究的熱點，具有廣闊的臨床應用前景。

本實驗選用反義RNA技術，人工合成NF-κB反義RNA基因質粒，通過抑制滑膜組織中NF-κB的表達，以NF-κB為靶點，抑制RA的發生和發展過程中各個環節的活化，最終達到抑制或減輕RA疾病的目的。

近年來，超聲造影劑微泡作為一種新型的、安全的、高效的基因靶向載體，是國內外研究的熱點課題。研究表明超聲照射本身就可以促進基因在體外和體內的轉染，而超聲通過擊破造影劑微泡，令進入血液循環中的微泡在指定部位“爆破”，釋放所攜帶的基因，微泡爆破產生的振蕩可增加真核細胞的通透性，有利于DNA分子穿透，提高了基因轉導和表達的效率[7]。近年來，體內外試驗均證明造影劑微泡在超聲作用下可增加外源基因轉染率和表達水平[8-10]。

我們也做了大量有關超聲微泡介導將空質粒轉染正常大鼠關節滑膜組織的研究，驗證了超聲聯合微泡這種基因轉染方法在關節疾病中應用的可行性，摸索了保證基因轉染成功的客觀條件[11-13]。在本研究中，我們應用超聲微泡介導這種新型的基因轉染方法，以NF-κB反義RNA為靶基因，進行RA的治療。本實驗發現，造模后，RA大鼠血清TNF-α和IL-1β水平明顯升高（與正常對照組比較，P＜0.01），提示這兩種細胞因子在RA的病理過程中發揮了重要作用。單純基因組、超聲+基因組、微泡+基因組、超聲+微泡+基因組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平均低于模型對照組（P＜0.05，P＜0.01），單純基因組、超聲+基因組、微泡+基因組3組之間比較無顯著性差異 （P＞0.05），超聲+微泡+基因組與單純基因組、超聲+基因組、微泡+基因組比較有顯著性差異 （P＜0.05）。實驗結果證明，所有實驗組均具有一定的治療作用，但是超聲+微泡+基因組的治療效果更顯著，提示超聲和微泡的聯合作用可以明顯提高基因的轉染效率，增強基因治療的療效。

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The effects of NF-κB antisense RNA gene on the levels of serum TNF-α and IL-1β in rheumatoid arthritis rats by ultrasound-mediated microbubble destruction

LIU Jie,JING Xiang-xiang,YANG Bing-ang,FU Shao-qing,WANG Dong-lin,WU Tang-na
(Hainan Provincial People’s Hospital,Haikou 570311,China)

Objective:To investigate the effect of NF-κB antisense RNA gene delivery mediated by ultrasound-mediated microbubble destruction on serum levels of TNF-α,IL-1β in rheumatoid arthritis(RA)rats and its feasibility for RA therapy.Methods:The layer-by-layer assembly technique was applied to attach multiple layers of gene and polyllysine onto prepared lipid-coated microbubbles(PLL+DNA+PLL Apply+DNA).Sixty rats were divided into six groups(10 rats with 20 knees in each group).Group A:normal control group;group B:blank control group of RA rats;group C:NF-κB antisense RNA gene plasmid group;group D:ultrasound+NF-κB antisense RNA gene plasmid group;group E:microbubbles+NF-κB antisense RNA gene plasmid group;group F:ultrasound+microbubbles+NF-κB antisense RNA gene plasmid group.The serum levels of TNF-α,IL-1β in RA rats were detected with ELISA.Results:The levels of serum TNF-α and IL-1β were obviously higher than normal control group.Those of group C to F were notably lower than that of the RA control group(P＜0.05,P＜0.01).There was no statistical difference in the levels of serum TNF-α and IL-1β among group C,D and E.But there was statistics difference between group F and group C to E(P＞0.05).Conclusion:NF-κB antisense RNA gene transfection efficiency on RA rat’s joints synovial tissues can be enhanced by ultrasound-mediated microbubble destruction,which can down-regulate the levels of serum TNF-α and IL-1β,and enhance the therapeutic effect of RA.

Arthritis,rheumatoid;Interleukin-1;Tumor necrosis factor-alpha;Ultrasonography,interventional

R593.22；R445.1

A

1008-1062（2016）12-0896-03

2016-03-28；

2016-06-02

劉潔（1970-），男，山西孝義人，主治醫師。E-mail：383432303＠qq.com

景香香，海南省人民醫院超聲科，570311。E-mail：jingxiangxiang＠sohu.com

國家自然科學基金（30860270）；海南省自然科學基金（30854，813208）。