皮膚鱗狀細胞癌中SDF-1/CXCR4的表達及意義

李珍玲，那佈其，王雪妍，崔銀姬，金雪梅，權春姬

皮膚鱗狀細胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma, CSCC)是起源于表皮或附屬器角質形成細胞的一種惡性腫瘤，是非黑素瘤皮膚腫瘤致死的首要原因?；|細胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1, SDF-1)又稱CXCL12，是由骨髓基質細胞產生的CXC類趨化因子，而CXCR4為其主要受體。近年研究證實，SDF-1和CXCR4廣泛、特異地表達于多種細胞與組織中，尤其是在多種腫瘤的發生、增殖、分化和器官特異性轉移中發揮重要作用[1-3]。盡管SDF-1/CXCR4在多種腫瘤中高表達，但其在CSCC組織中表達的研究較少。本實驗采用免疫組化EnVision法檢測SDF-1、CXCR4蛋白在CSCC、鮑溫病(Bowen’s disease, BD)和癌旁正常皮膚組織中的表達，進一步探討其在CSCC發生、發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料選擇2011年1月～2018年3月吉林省延邊大學附屬醫院存檔的手術切除的100例CSCC、32例BD、15例癌旁正常皮膚組織，另選取CSCC組織芯片(購自上海芯超生物公司)58點作為實驗樣本。158例CSCC中，男性83例，女性75例，年齡35～96歲，平均(72.03±13.53)歲。32例BD中，男性15例，女性17例，年齡52～85歲，平均(70.83±9.12)歲。所有患者術前均未行放、化療。

1.2 主要試劑兔抗人SDF-1、CXCR4多克隆抗體購自北京博奧森生物公司和武漢伊萊瑞特生物公司，HRP標記山羊抗小鼠/兔二抗、PV 6000試劑盒、DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物公司。

1.3 免疫組化采用免疫組化EnVision法染色。染色步驟：3 μm厚常規切片，脫蠟至水，EDTA 9.0高壓抗原熱修復，3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶，10%正常山羊血清封閉后，滴加一抗SDF-1(稀釋比1 ∶100)、CXCR4(稀釋比1 ∶60)4 ℃過夜；次日PBS洗滌后加入二抗，37 ℃孵育50 min，DAB顯色，蘇木精復染，脫水，透明，中性樹膠封固，鏡下觀察。以乳腺癌組織作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判斷SDF-1、CXCR4表達定位于細胞膜/胞質，隨機觀察10個高倍視野，每個視野計數100個細胞，根據其中陽性細胞所占百分比和染色強度分別進行評分。(1)按陽性細胞所占百分比評分：陽性細胞數<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分；(2)按染色強度評分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項評分結果相乘：0～1分為陰性(-)，2～3分為(+)，4～5分為()，6分以上為()。將(～)視為強陽性。

1.5 統計學分析采用SPSS 24.0軟件進行統計學分析，計數資料以頻數表示，采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同皮膚組織中SDF-1、CXCR4蛋白表達染色特點SDF-1、CXCR4陽性均定位于細胞質，陽性細胞呈棕黃色顆粒狀。在正常皮膚組織中SDF-1陽性細胞少量分布于基底層細胞且呈弱陽性(圖1A)，在BD中陽性細胞主要分布于表皮全層異型細胞(圖1B)。在高分化CSCC中SDF-1弱表達于角化珠周邊近基底部的腫瘤細胞(圖1C)，中～低分化CSCC中強表達于所有腫瘤細胞(圖1D)。CXCR4在正常皮膚及BD全層表皮中表達(圖2A、B)，并且在毛囊、皮脂腺部位也有表達，強弱不等。在高分化CSCC中主要表達于角化珠周邊棘層(圖2C)，中～低分化CSCC中彌漫表達于幾乎所有的腫瘤細胞，強弱不等(圖2D)。

圖1 SDF-1在不同皮膚組織中的表達：A.癌旁正常皮膚組織；B.鮑溫?。籆.高分化皮膚鱗狀細胞癌；D.中～低分化皮膚鱗狀細胞癌，EnVision法 圖2 CXCR4在不同皮膚組織中表達：A.癌旁正常皮膚組織；B.鮑溫??；C.高分化皮膚鱗狀細胞癌；D.中～低分化皮膚鱗狀細胞癌，EnVision法

2.2 不同皮膚組織中SDF-1、CXCR4的表達SDF-1在癌旁正常皮膚、BD和CSCC組織中的陽性率呈上升趨勢，其陽性率分別為33.33%、68.75%、87.97%、差異有統計學意義(P<0.001，P<0.05，表1)。CXCR4在癌旁正常皮膚、BD、CSCC組織中的陽性率分別為73.33%、75.00%、86.08%，差異無統計學意義(P>0.05，表2)。在CSCC中SDF-1和CXCR4強陽性率分別為44.93%和40.51%，顯著高于BD中的強陽性率，差異有統計學意義(P<0.05，表3)。

表1 不同皮膚組織中SDF-1的表達

表2 不同皮膚組織中CXCR4的表達

表3 鮑溫病和皮膚鱗狀細胞癌中SDF-1和CXCR4的強陽性率

2.3 CSCC中SDF-1、CXCR4表達與臨床病理特征之間的關系分析SDF-1、CXCR4蛋白表達與CSCC臨床病理特征之間的相關性，結果顯示SDF-1高表達與CSCC分化程度和侵襲程度相關(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤大小、皮損部位、有無神經脈管浸潤無關(P均>0.05)。CXCR4高表達與腫瘤侵襲程度相關(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤大小、皮損部位、分化程度、是否神經脈管浸潤無關(P>0.05，表4)。

表4 SDF-1和CXCR4蛋白表達與皮膚鱗狀細胞癌臨床病理特征的關系[n(%)]

3 討論

CSCC是僅次于基底細胞癌的第二常見的皮膚惡性腫瘤，好發于老年人，具有較強的惡性趨勢，主要發生于曝光部位的皮膚，尤其是面、頸、手背。BD又稱為原位鱗狀細胞癌，進展緩慢，3%～5%病變演變成侵襲性鱗狀細胞癌[4]。CSCC的發生、發展涉及多基因和多種分子水平共同作用，是一個極其復雜的過程。趨化因子家族是腫瘤微環境的重要組成部分，其是多肽細胞因子的超家族，具有激活、趨化白細胞作用，許多疾病的發生均需要趨化因子的參與[5]。SDF-1稱為基質細胞衍生因子，屬于趨化因子CXC亞家族，主要由骨髓基質分泌，具有趨化作用。CXCR4是SDF-1的特異性受體，兩者具有高度親和力，兩者結合后激活多條下游信號通路，在免疫反應、炎癥、器官發育、血管生成、惡性腫瘤的浸潤轉移等方面發揮重要作用[6]。

研究表明，腫瘤組織高表達SDF-1可以提高腫瘤細胞的運動能力，甚至促進其上皮-間質轉化，促進其向周圍組織浸潤[7-8]，而高表達CXCR4的腫瘤細胞遷移能力增強，并具有直接調控作用。多個研究已發現SDF-1/CXCR4生物學軸與腫瘤的關系密切，并已證明與患者的不良預后相關[9-10]，但在CSCC中的報道少見。Gong等[11]研究發現SDF-1在CSCC中表達增高，隨著SDF-1的濃度增加A-431細胞的遷移能力增強，而這種遷移能力被AMD3100所抑制。本組前期實驗結果顯示，在CSCC中SDF-1 mRNA表達水平顯著高于正常表皮[12]，同樣本實驗結果顯示，SDF-1蛋白在BD和CSCC組織中表達上調，進一步發現SDF-1蛋白的高表達與腫瘤分化程度呈負相關，與腫瘤的侵襲程度呈正相關，提示SDF-1高表達與CSCC的發生、發展相關。CXCR4作為SDF-1的特異性受體，在不同類型的癌癥中廣泛存在，一項非小細胞肺癌的薈萃分析顯示，轉移性非小細胞肺癌中CXCR4的表達量明顯高于非轉移性非小細胞肺癌[13]，動物實驗表明，高表達CXCR4的腫瘤細胞，在SDF-1趨化、牽引下轉移至SDF-1表達較高的某些器官，形成器官特異性轉移。臨床研究顯示，CXCR4高表達與腫瘤淋巴結轉移，復發、患者的低生存期密切相關[14-15]。本實驗結果顯示，CXCR4在CSCC中表達模式與其他腫瘤略有不同。首先，CXCR4蛋白在癌旁正常皮膚組織、BD、CSCC中表達無差異，在正常皮膚組織中的表皮、毛囊、皮脂腺中均有表達，這與Ciurea等[16]報道的CXCR4在正常皮膚中表達模式較一致。雖然CXCR4在三種不同皮膚組織中的表達差異無明顯性，但在表達強度層面上分析發現CSCC中表達更強于BD，并與腫瘤侵襲深度相關，從而提示CXCR4在CSCC的進展中具有重要作用。

綜上所述，本實驗發現SDF-1和CXCR4在CSCC中表達上調，兩者可能共同作用促進CSCC的發生、發展。大量的體內外實驗已證明，抑制SDF-1/CXCR4的功能對控制惡性腫瘤的轉移有顯著效果，隨著CXCR4抑制劑的發現，有望將SDF-1/CXCR4為分子靶點使CSCC的治療取得新突破。