云南省西雙版納勐海縣學(xué)齡前兒童地貧調(diào)查及基因單倍型分析

[摘要]目的：對西雙版納州勐海縣學(xué)齡前兒童進(jìn)行地中海貧血的流行病學(xué)調(diào)查和基因單倍型分析。方法：勐海縣婦幼保健院體檢的兒童應(yīng)用血紅蛋白電泳聯(lián)合血常規(guī)篩查地貧，同時對所有病例進(jìn)行α-地貧、β-地貧基因檢測.應(yīng)用連鎖分析和限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性方法分析當(dāng)?shù)氐刎毴巳旱幕騿伪缎汀＝Y(jié)果：在103名受檢的學(xué)齡前兒童中，確診α-地貧者14例，β地貧9例，α-地貧復(fù)合β-地貧2例， α-地貧基因攜帶率15.5%，β-地貧基因攜帶率12.6%。檢出5種與地貧相關(guān)的基因單倍型。結(jié)論：西雙版納州勐海縣是地貧高發(fā)地區(qū)，研究結(jié)果有助于當(dāng)?shù)氐刎毞揽赜行ч_展.

[關(guān)鍵詞]地中海貧血：云南省；基因單倍型

地中海貧血是我國南方各省影響最大、發(fā)病率最高的遺傳病之一，多見于廣東、廣西、云南、海南等省。重型地貧患兒需要終生輸血治療，常因慢性溶血性貧血和鐵離子負(fù)荷，導(dǎo)致肝脾腫大、心肌損害，最終治療無效死亡。中間型地貧患者也會因持續(xù)的慢性溶血性貧血而出現(xiàn)生長發(fā)育遲緩、體能低于正常人。輕型地中海貧血可無臨床癥狀，極易被漏診、誤診。世居于云南省內(nèi)，人口超過百萬的少數(shù)民族如傣族、壯族已經(jīng)被報道是地貧高發(fā)的民族。不同民族地貧類型構(gòu)成比以及發(fā)病情況有較大區(qū)別，對地貧高發(fā)地區(qū)進(jìn)行流行病學(xué)研究有助于地貧防控的有效開展，但目前為止尚無明確系統(tǒng)的研究了解云南省兒童地貧狀況特別是少數(shù)民族中血紅蛋白病的流行狀況。本文報道西雙版納勐海縣婦幼保健院2013年2月至2013年7月期間，對103例兒童進(jìn)行地貧篩查及地貧家系研究的臨床研究結(jié)果。

1資料和方法

1.1資料來源

研究對象為2013年2月-2013年7月在云南省西雙版納州勐海縣婦幼保健院進(jìn)行體檢的6月-6歲兒童103人，同時對患者進(jìn)行血常規(guī)、血紅蛋白電泳篩查以及地貧基因診斷，同時登記登記受檢者的姓名、編號、民族、籍貫、年齡等信息，血紅蛋白電泳、血常規(guī)資料和基因診斷結(jié)果輸入Excel軟件數(shù)據(jù)庫中保存。

1.2方法

1.2.1血紅蛋白電泳篩查

受檢者進(jìn)行檢查時抽取受檢兒童靜脈血2ml，EDTA抗凝，4-8℃冷藏保存1-5天內(nèi)檢測。采用血紅蛋白電泳法定量檢測各血紅蛋白成份的比例，分析異常血紅蛋白區(qū)帶。

1.2.2血常規(guī)檢測

用貝克曼LH750型全自動血液分析儀進(jìn)行檢測，主要觀察的參數(shù)：平均紅細(xì)胞血紅蛋白量（MCH）、平均紅細(xì)胞體積（MCV）、紅細(xì)胞血紅蛋白量（Hb）、紅細(xì)胞體積分布寬度（RDW）以及平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）。α-地貧分子篩查的血液學(xué)指標(biāo)是：MCV<80fL，MCH<27Pg，HbA2<2.5%；β-地貧進(jìn)行分子篩查的血液學(xué)指標(biāo)是：①MCV<80 H，MCH<27pg和HbA2>3.5%；②表現(xiàn)出HbE電泳帶或者其它異常條帶；③HbF>5.0%。

1.2.3地貧基因診斷

α-或β-珠蛋白基因常見突變檢測：使用深圳亞能生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的地貧基因診斷試劑盒，采用PCR-反向斑點雜交法（PCR-reversed dot blotting，PCR-RDB），檢測中國人群。β-珠蛋白基因常見17個位點的18種突變；采用多重PCR法檢測。一珠蛋白基因常見的3種缺失：-SEA（東南亞缺失型）、-α3.7（右缺失型）、-α4.2（左缺失型）。

1.2.4珠蛋白基因單倍型分析

對9例本次確診。一地貧和以往收集的7例確診β-地貧的家系，進(jìn)行β-珠蛋白基因單倍型的研究。采用基于PCR的RFLP技術(shù)和家系連鎖分析方法確定先證者兩條β-地貧染色體的單倍型，選擇的7個RFLP位點分別是：Hind Ⅱ-5′ε，HindⅢ-Cγ，Hind Ⅲ Aγ，Hind Ⅱ-ψβ，HincⅡ-3′ψβ，AvaⅢ-β，BamHI-3′β。引物、實驗條件以及單倍型命名原則參見文獻(xiàn)。

2結(jié)果

2.1地貧基因診斷結(jié)果

對103例兒童進(jìn)行血常規(guī)聯(lián)合血紅蛋白電泳篩查；根據(jù)篩查結(jié)果，α-地貧篩查陽性病例進(jìn)行3種缺失型。α-地貧的檢測，β-地貧篩查陽性病例進(jìn)行18種常見β-地貧的檢測以及3種缺失型。α-地貧的檢測。共檢出14例。α-地貧，9例β-地貧（2例為重癥β-地貧患兒），2例α-地貧合并β-地貧（-α3.7合并CD17型1例，-α4.2合并CD26型1例）。α-地貧的基因攜帶率是15.53%（16/103），β-地貧的基因攜帶率是12.62%（13/103）。

2.2基因單倍型分析結(jié)果

使用連鎖分析和RFLP技術(shù)分析共16例確診β-地貧的家系的基因單倍型，其中有7個家系未能提供連鎖信息，不能檢測出基因單倍型類型。9例確診。β-地貧的家系中，發(fā)現(xiàn)CD41-42突變類型有三種相關(guān)的基因單倍型類型（Ⅶ、Ⅴ、Ⅰ），CD17突變類型的基因單倍型為Ⅶ，CD26突變類型的基因單倍型為Ⅲ、CD27/28突變類型的基因單倍型為Ⅳ。共發(fā)現(xiàn)5種與β-地貧相關(guān)的基因單倍型類型，其中以類型Ⅶ最為多見。

3討論

血紅蛋白電泳聯(lián)合血常規(guī)在地中海貧血篩查過程中起非常重要的作用，其能夠定量檢測各種血紅蛋白水平，并將地中海貧血初步分為α-型和β-型，為進(jìn)一步進(jìn)行基因診斷和遺傳咨詢提供基礎(chǔ)。血液學(xué)篩查對靜止型地中海貧血患者存在漏診風(fēng)險，且年齡小于1歲兒童，血液中HbF水平較高會對篩查產(chǎn)生干擾。對于α-地貧合并β-地貧的情況，血紅蛋白電泳多顯示為HbA2的明顯升高，臨床上對疑似β-地貧的患者，需要加做α-地貧的基因診斷（研究中檢出2例α-地貧合并β-地貧的病例）。此外，兒童及嬰幼兒不宜多次反復(fù)抽血。綜合以上幾點原因，我們在研究人群中一次抽取靜脈血2ml，直接進(jìn)行血紅蛋白電泳聯(lián)合血常規(guī)篩查以及常見。α-、β-地貧的基因診斷，以高效準(zhǔn)確的提高檢出率。

本調(diào)查表明，勐海縣送檢兒童α-地貧的檢出率是15.53%，β-地貧的檢出率是12.62%，西雙版納勐海屬于地貧高發(fā)地區(qū)，受檢兒童中有2例為重癥。地貧患兒，高達(dá)近2%。這樣地貧高發(fā)的情況與相鄰地區(qū)泰國的傣族人群地貧發(fā)病率相似。西雙版納地貧的單倍型顯示出多種類型，提示這些地方的民族可能有多次的遺傳交流，顯示出豐富的基因多態(tài)性。在本地區(qū)地貧高發(fā)這一背景下，進(jìn)行地貧篩查并對高危人群以及基層醫(yī)務(wù)人員宣傳是有重要意義的，有望減少重型地貧兒的出生率，降低圍生兒病死率，提高人口健康素質(zhì)。地貧貧血的血常規(guī)為小細(xì)胞低色素性，與小兒缺鐵性貧血有著共同點。后者補鐵是主要的治療措施，但地貧患兒由于體內(nèi)鐵沉積不能補鐵。在地貧高發(fā)地區(qū)進(jìn)行輕型地貧篩查，能提高當(dāng)?shù)氐刎毞揽匾庾R，可為嬰幼兒期貧血的診斷及鑒別診斷提供實驗室依據(jù)，并提升醫(yī)務(wù)人員對疾病認(rèn)識的水平，避免不必要的漏診、誤診和錯誤治療。

本研究在國內(nèi)首次對西雙版納州少數(shù)民族地區(qū)兒童進(jìn)行了地貧流行病學(xué)的調(diào)查研究，為今后進(jìn)一步地貧防控與疾病認(rèn)識提供了科學(xué)依據(jù).但本研究樣本量較小僅103人，當(dāng)?shù)厝朔N來源復(fù)雜，且就診兒童會存在選擇偏倚，一部分學(xué)齡前兒童父母由于認(rèn)識不到位等原因放棄體檢，若真實了解西雙版納地區(qū)兒童地貧發(fā)病率，還需要進(jìn)行分層次大樣本的流行病學(xué)研究。西雙版納地區(qū)地貧廣泛存在也有必要進(jìn)一步推廣在人群中地貧攜帶者篩查，對攜帶者夫婦提供遺傳咨詢和產(chǎn)前基因診斷服務(wù)，提高出生人口素質(zhì)，促進(jìn)民族團結(jié)，避免重癥地貧患兒出生。