UPLC/Q-TOF-MS技術快速鑒定瑤藥別旁茶提取物的化學成分

王鳳云，韓亮，宋雨鴻

(1.廣東藥學院 中藥學院，廣東 廣州 510006； 2.廣州市第一人民醫院 中醫科，廣東 廣州 510180)

?

UPLC/Q-TOF-MS技術快速鑒定瑤藥別旁茶提取物的化學成分

王鳳云1，韓亮1，宋雨鴻2

(1.廣東藥學院 中藥學院，廣東 廣州 510006； 2.廣州市第一人民醫院 中醫科，廣東 廣州 510180)

摘要:目的 采用UPLC/Q-TOF-MS技術快速分析和鑒定瑤藥別旁茶的化學成分。方法 采用AQUITY UPLC/Q-TOF micro聯用儀，以0.1%(體積分數，下同)甲酸-乙腈為流動相梯度洗脫，ESI正負離子模式下采集數據，以Masslynx4.1軟件分析數據，根據正、負離子質譜數據及元素組成分析，結合對照品和相關文獻得出結果。結果 共檢測了29個色譜峰，鑒定了其中的26個化合物。結論 UPLC/Q-TOF-MS技術分析可獲得別旁茶中各類化學成分豐富的結構信息，為這些化學成分的鑒定提供了一種快速有效的方法，為闡明別旁茶的藥效物質基礎提供了有力依據。

關鍵詞:別旁茶； UPLC/Q-TOF-MS； 化學成分

扭肚藤為木犀科素馨屬植物扭肚藤Jasminumelongatum(Bergius) Willd.的干燥嫩莖及葉，瑤名別旁茶。因其善于治療濕熱腹痛瀉痢，故名扭肚藤；又因為其花為白色，形似素馨花，故又名為白花茶、假素馨。扭肚藤具有清熱利濕的作用，瑤族常用于治療濕熱腹痛、腸炎、痢疾、四肢麻痹腫痛、瘰癘、疥瘡，外用可以用于跌打骨折和類風濕性關節炎[1]。目前對扭肚藤的研究報道較少，化學成分所知甚少，國內有報道采用HPLC法測定扭肚藤中東莨菪內酯的質量分數[2]，還有分別對復方扭肚藤片和腹可安片中的扭肚藤相關成分進行研究的報道[3-4]；但是絕大部分的化學成分仍是未知的。為了明確別旁茶的活性成分并闡述該藥的物質基礎和作用機制，有必要開展其化學成分研究。

超高效液相色譜(UPLC)技術是近年發展起來的分離技術，具有超高壓、超高靈敏度、超高分離度等特點，在中藥等復雜體系的分離分析上具有明顯優勢。飛行時間串聯質譜儀(Q-TOF-MS)是高分辨串聯質譜，其顯著特點是高靈敏度、高選擇性，能得到高質量的質譜圖和化合物的精確分子量；因此， UPLC/Q-TOF-MS技術已成為目前中藥復雜體系中活性成分的快速分離和鑒定的有力手段。本試驗首次應用UPLC/Q-TOF-MS技術，對瑤藥別旁茶進行了研究分析，根據色譜保留時間、精確分子量、準分子離子、碎片離子和相關文獻，對主要色譜峰的化學結構進行了推斷和鑒定，為全面分析別旁茶化學成分、闡明其藥效物質基礎和控制質量奠定基礎。

1材料與方法

1.1儀器與試藥

超高效液相串聯四級桿飛行時間質譜聯用儀(美國Waters公司)，Waters Aqpuity uplc beh C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，數據采集采用Masslynx4.1軟件；KQ-500VDE型雙頻數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，頻率45/80 kHz，功率500 W)，BT-224S萬分之一電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)，TGL-16C高速離心機(上海安亭科學儀器廠)，SK-1快速混勻器(常州澳華儀器有限公司)，0.22 μm溶劑過濾器(天津津騰儀器廠)。

乙腈、甲酸(UPLC級，德國Merck公司)，甲醇(HPLC級，德國Merck公司)，娃哈哈蒸餾水。

別旁茶(廣東和翔制藥有限公司，批號：20151124)，經廣東藥學院中藥學院潘利明副教授鑒定為木犀科素馨屬植物扭肚藤Jasminumelongatum(Bergius) Willd.的干燥嫩莖及葉。對照品東莨菪內酯(批號：110768-200504，中國藥品生物制品檢定所)，山柰酚-3-O-蕓香糖苷(批號：MB2122，大連美侖生物技術有限公司)，橄欖苦苷(批號：81345-57-9)、苜蓿素(批號：96575-10-5)購自天津一方科技有限公司。

2方法、結果與分析

2.1供試品溶液的制備

取別旁茶藥材50 g，精密稱定。粉碎過40目篩，依次加入50%(體積分數)乙醇10倍、8倍量冷凝回流提取各1 h，合并2次提取液，濾過。濾液減壓蒸餾至浸膏狀，用甲醇稀釋至50 mL，備用。溶液進樣前15 000 r/min離心10 min，取上清液，即得。

2.2對照品溶液的制備

分別取東莨菪內酯、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、橄欖苦苷和苜蓿素對照品粉末1 mg，精密稱定，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3檢測條件

色譜條件：色譜柱為Waters acquitytm uplc beh C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫條件為0～3 min，5%A→13%A；3～10 min，13%A→30%A；10～15 min，30%A→45%A；15～28 min，45%A→95%A；28～29 min，95%A→100%A；柱溫為35 ℃；流速為0.4 mL/min；進樣量為5 μL。

質譜條件：毛細管電壓為3 000 V；錐孔電壓為30 V；離子源溫度為120 ℃；脫溶劑氣體溫度為350 ℃；裂解能量CE(±)為15～25 V。脫溶劑(N2) 流速為600 L/h，錐孔反吹N2，流速為60 L/h；溶劑氣為N2；碰撞氣體為Ar。采用Lock mass通路對試驗數據采集進行實時校正，Lock mass對照品溶液為腦腓肽(10 μg/mL)，校正切換頻率為10次/s。掃描范圍為100～1 500，檢測時間為20 min。ESI正負離子模式下采集數據。

2.4UPLC/Q-TOF-MS成分鑒定

按“2.3”項下條件對供試品、對照品溶液進行分析，得到別旁茶的正、負基峰離子(BPI)色譜圖，如圖1所示。總離子流圖中檢測出的各個色譜峰經Masslynx4.1軟件進行了檢索，正離子模式下檢測離子主要以[M+H]+、[M+NH4]+為主；負離子模式下檢測離子主要以[M-H]-、[M+HCOO]-為主。按上述色譜條件測定，別旁茶中不同極性化合物得到了較好分離。

96-4100-0強度/%10121416182022242468t/minAB

圖1別旁茶負(A)、正(B)離子模式下的UPLC/Q-TOF-MS總離子流圖

Figure 1BPI chromatograms of (-) ESI-MS mode (A) and (+) ESI-MS mode (B) ofJ.elongatum.

圖1總離子流圖中的29種成分的鑒別結果如表1所示。根據Masslynx4.1工作站給出的精確分子量、可能的分子式、二級質譜碎片數據及相關文獻，以及應用網絡資源scifinder及chemspider數據庫檢索數據，從別旁茶中共檢測分析出26種成分。除已知的東莨菪內酯和3個未鑒別的成分外，其余成分均首次在別旁茶中被發現。主要包括環烯醚萜苷類成分，如峰1、10、11、14、15、17、18、22、23、27、29共11種，黃酮及其黃酮苷類成分，如峰5、20、21、23共4種，木脂素類成分，如峰6、7、13共3種，內酯類成分，如峰4、16、19共3種，咖啡酸葡萄糖苷酯類成分，如峰8、9共2種，有機酸類成分，如峰2、25共2種，生物堿類成分，如峰24等。

表1　別旁茶化學成分的UPLC/Q-TOF-MS鑒定結果

續表1

2.5別旁茶中環烯醚萜苷類成分的質譜裂解規律探討

從檢測結果來看，環烯醚萜苷類成分是別旁茶的主要活性成分，采用UPLC-MS/MS對這類成分進行分析表征，探討其質譜裂解規律，闡明其主要碎片離子的形成過程，對別旁茶中新的化合物的預測與發現有重要意義。峰10、18在正負離子模式下均有較高的響應，圖2、圖3分別為峰10和峰18的質譜分析圖，二者分別鑒定為橄欖苦苷和jasminoside。

100-0100-0100-0強度/%BACESI(-)ESI(-)ESI(+)100140180220260300340380420460500540580m/z

圖2峰10在ESI(+)和(-)模式下的二級(A)和一級(B、C)質譜圖

Figure 2MS2data (A) and MS data (B,C) of positive and nagative ESI-MS modes of No.10

100-0100-0100-0強度/%BACESI(-)ESI(-)ESI(+)100140180220260300340380420460500540580m/z

圖3峰18在ESI(+)和(-)模式下的二級(A)和一級(B、C)質譜圖

Figure 3MS2data (A) and MS data (B,C) of positive and nagative ESI-MS modes of No.18

峰10和峰18是環烯醚萜苷類成分的典型代表，二者質譜裂解途徑相似，僅豐度上稍有差別，根據其質譜分析圖推測二者可能的質譜裂解途徑見圖4～圖5。

通過峰10和峰18的質譜裂解途徑，推斷環烯醚萜苷類成分首先脫去1位的葡萄糖或葡萄糖苷，隨著碎裂電壓的增大，而后脫去側鏈基團如C9H9O2或C8H9O3，最后再丟失連接在母核的—CO2、—CH3或—OH等基團。這為后期發現更多類型的環烯醚萜苷類成分奠定了良好的基礎。

圖4　峰10的質譜裂解途徑

圖5峰18的質譜裂解途徑

Figure 5The mass spectrometry fragmentation pathways of peak No.18

3結論

本研究建立了別旁茶的UPLC/Q-TOF-MS分析方法，在正負離子模式下別旁茶的化學成分得到快速的分離和鑒定。運用UPLC/Q-TOF-MS的數據庫匹配技術和相關文獻，共檢測到29種化學成分，并鑒定了其中的26種，包括環烯醚萜苷類成分11種，黃酮及黃酮苷類成分4種、木脂素類成分3種和內酯類成分3種等，其中包括橄欖苦苷和jasminoside在內的25種化學成分為首次從別旁茶中發現。本研究較為全面地分析和鑒定了別旁茶中的化學成分，為深入研究其藥理作用、尋找其藥效活性成分，進而更好地開發應用提供了強有力的依據和前期研究基礎。

參考文獻:

[1] 孔令鋒,李書淵.扭肚藤的生藥學研究[J].廣東藥學院學報,2008,24(5):449-451.

[2] 彭維,王小銳.HPLC法測定扭肚藤藥材中東莨菪素的含量[J].中藥材,2007,30(5):563.

[3] 蘇薇薇,鄧裘家.復方扭肚藤片中扭肚藤的薄層層析鑒別[J].中成藥,1990,12(12):15-16.

[4] 吳忠,羅健.腹可安片中扭肚藤、救必應、石榴皮的薄層層析鑒別[J].廣東醫藥學院學報,1994,10(2):92-93.

[5] 張正付,邊寶林,田秀峰.素馨屬植物化學成分及藥理活性研究進展[J].中國中藥雜志,2004,29(12):1209-1212.

[6] 孫佳明.破骨風和山梗菜化學成分研究[D].北京：中國協和醫科大學,2007.

[7] SHEN Y C, CHEN C H.Novel secoiridoid lactones fromJasminummultiflorum[J]. J Nat Prod,1989,52(5):1060.

[8] CHEN H Y.Jasmultiside,a new secoiridoid glucoside fromJasminummultiflorum[J].J Nat Prod,1991,54(4):1087.

[9] INOUE K,FUJITA T,INOVYE H,et al.Four secoiridoid glycosides fromJasminummesnyi[J].Phytochemistry,1991,30(4):1191.

[10] TRVJILLO J M, HEMANDEZ, J M, PEREZ J A，et al. A new secoiridoid glucoside fromJasminumodoratissimum[J].Phytochemistry,1996,42(2):553.

[11] 趙桂琴,夏晶晶,董俊興.素馨花糖苷類化學成分研究[J].藥學學報,2007,42(10):1066-1069.

[12] 趙桂琴,尹志峰,董俊興.素馨花中一個新的環烯醚萜苷[J].藥學學報,2008,43(5):513-517.

(責任編輯：劉曉涵)

UPLC/Q-TOF-MS based rapid analysis and identification of chemical composition ofJasminumelongatum(Bergius) Willd.

WANG Fengyun1，HAN Liang1， SONG Yuhong2

(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.GuangzhouFirstMunicipalPeople'sHospital,Guangzhou510180，China)

Abstract:Objective To make a qualitative analysis on chemical components in Jasminum elongatum (Bergius) Willd. by UPLC/Q-TOF-MS. Methods AQUITY UPLC/Q-TOF micro system was employed with gradient elution of 0.1% formic acid-methyl cyanides as the mobile phase under the ESI positive and negative modes. Data was analyzed by masslynx 4.1 software. Results 29 peaks were profiled and 26 compounds of J. elongatum were identified by UPLC-MS. Conclusion It provided an accurate and fast method to identify the main components from J. elongatum,as well as powerful support for clarifying the element composition.

Key words:Jasminum elongatum (Bergius) Willd.; UPLC/Q-TOF-MS; chemical components

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015122001

中圖分類號:R284.1

文獻標志碼：A

文章編號:1006-8783(2016)01-0055-06

作者簡介：王鳳云(1979—)，女，博士，從事中藥資源開發及質量評價研究，電話：020-39352182，Email:wfycn2000@163.com；通信作者：宋雨鴻(1981—)，男，博士，副主任醫師，從事中西醫結合消化疾病治療，Email：562832197@qq.com。

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81503352)

收稿日期：2015-12-20

網絡出版時間：2016-01-19 16:01網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160119.1601.002.html