穿心蓮內酯對前列腺癌細胞的增殖及神經內分泌分化的抑制作用

周大磊，章倩倩，劉紅英，段有發，王麗京

(1.廣東藥學院 基礎學院，廣東 廣州 510006； 2.廣東省中醫院，廣東 廣州 510120)

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穿心蓮內酯對前列腺癌細胞的增殖及神經內分泌分化的抑制作用

周大磊1，章倩倩1，劉紅英2，段有發1，王麗京1

(1.廣東藥學院 基礎學院，廣東 廣州 510006； 2.廣東省中醫院，廣東 廣州 510120)

摘要:目的 探討穿心蓮內酯(Andro)對前列腺神經內分泌癌細胞增殖及神經內分泌分化的影響。方法 Andro處理前列腺癌細胞(PC3)，用MTT法檢測48 h時Andro作用的最大效應濃度及對PC3細胞增殖的時間依賴性；進一步提取細胞蛋白，通過Western blotting檢測神經內分泌分化標志物(NSE、CgA)表達情況。結果 Andro作用48 h時7.5 μmol/L達到最大效應濃度，且隨著時間的延長Andro抑制PC3細胞增殖的作用越顯著；Andro能明顯抑制PC3細胞的增殖，并具有濃度和時間依賴性。Western blotting 檢測結果顯示，NSE、CgA是PC3細胞中神經內分泌的標志物，Andro能顯著抑制NSE、CgA的表達。結論 Andro可抑制PC3細胞增殖及神經內分泌分化。

關鍵詞:穿心蓮內酯； 前列腺癌； 細胞增殖； 神經內分泌分化

穿心蓮內酯(andrographolide，Andro)是天然抗炎植物藥穿心蓮主要有效成分之一，為二環雙萜內酯類化合物。近年來研究發現，Andro具有免疫調節、抗腫瘤、治療糖尿病、降低血壓、抑制血小板聚集及抗血栓形成等作用[1-2]。本實驗室前期研究已經證明Andro對口腔癌[3]、胰島素瘤[4]以及黑色素瘤[5]具有明顯的抑制作用，盡管Andro抗腫瘤作用已被證實，但其對前列腺癌神經內分泌分化的作用研究尚無報道。前列腺癌是男性常見的泌尿生殖系統惡性腫瘤之一，居全球癌癥發病率第5位[6]，在美國其發病率高居男性惡性腫瘤首位[7]。近年來，隨著我國經濟的發展，我國前列腺癌發病率日趨上升。目前，臨床上治療前列腺癌的主要方法為雄激素去勢療法。但是，雄激素阻斷療法對前列腺癌組織內的神經內分泌分化基本無效[8]，并且預后差[9]，患者平均生存時間5～17.5個月[10]。所以尋找治療前列腺癌神經內分泌分化的藥物，改善前列腺癌患者生活質量具有重要的臨床意義。本文選用人源的具有神經內分泌特性的前列腺癌細胞株PC3為體外模型，研究Andro對前列腺癌神經內分泌分化的作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器Thermo Scientific Series 8000 水套CO2培養箱(賽默飛世爾)；AIRTECH超凈工作臺(蘇凈安泰)；美國BioTek ELx800通用酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)；GE ImageQuant LAS 4000化學發光成像分析儀(美國通用)；恒溫振蕩金屬浴(賽默飛世爾)；Thermo Scientific MicroCL 17微量離心機(賽默飛世爾)；Thermo Scientific Heraeus Multifuge X1系列離心機(賽默飛世爾)。

1.1.2藥物與試劑Andro(西格瑪奧德里奇，純度：98%)；MTT(西格瑪奧德里奇，純度：98%)；二甲基亞砜(上海生工)；DMEM(Gibco)；青霉素/鏈霉素(Gibco)；0.25%胰蛋白酶-EDTA(1X)(Gibco)；胎牛血清(賽默飛)；Anti-Chromogranin A 抗體(默克密理博)；Human/Mouse Enolase 2/Neuron specific Enolase 抗體(R&D Systems)；GAPDH (14C10) 兔單克隆抗體(Cell Signaling Technology)。

1.2方法

1.2.1MTT比色法檢測細胞增殖以3×104個/mL的細胞密度將PC3細胞接種于96孔培養板，每孔100 μL，按實驗要求加入終濃度為0、2.5、5、7.5、10、12.5、15 μmol/L的Andro，并設立溶劑DMSO對照組，每組設5個平行孔，于48 h檢測Andro作用細胞的最大效應濃度。并用Andro作用的最大效應濃度處理PC3細胞，培養0、24、48、72 h，觀察隨著時間的延長，Andro對PC3細胞增殖作用的影響。檢測時每孔加入MTT工作液10 μL，37 ℃孵育4 h，去除上清液后加入150 μL的DMSO，置于37 ℃恒溫搖床，10 min后通過酶標儀檢測490 nm 處吸光度值(A490)，實驗重復3次。

1.2.2蛋白質免疫印跡實驗以5×104個/mL的細胞密度將PC3細胞接種于12孔培養板，每孔1 mL，繼續培養24 h后，將細胞隨機分為2組：DMSO對照組、7.5 μmol/L Andro給藥組。48 h后，用預冷的PBS洗3次，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液50 μL，冰上裂解30 min，然后以4 ℃，13 000×g離心10 min，收集上清液保存于-80 ℃備用。

用BCA法精確測量兩組組蛋白質含量后，取等量蛋白質加入各電泳通道 (約40 μg)。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉膜。5%脫脂牛奶室溫搖床封閉1 h，TBST(pH=7.6)清洗3次，5 min/次，分別加入Anti-Chromogranin A(CgA)抗體(1∶3 000)、Neuron specific Enolase(NSE)抗體(1∶3 000)(NSE和CgA均為神經內分泌分化標志物)以及內參GAPDH(1∶10 000)，4 ℃孵育過夜，TBST清洗3次，5 min/次，加入辣根過氧化物酶標記二抗(1∶10 000)，室溫孵育1 h，再用TBST清洗3次，5 min/次，ECL法顯色。

2結果

2.1Andro對PC3細胞增殖抑制作用的最佳效應濃度

采用不同藥物濃度(0、2.5、5、7.5、10、12.5、15 μmol/L)Andro處理PC3細胞，48 h后通過MTT法檢測發現，與對照組相比，Andro抑制PC3細胞增殖的作用隨著濃度的增加而逐漸降低。并且，在7.5 μmol/L時達到最佳效應濃度，抑制率達到21%，差異有統計學意義(P<0.01)。表明Andro濃度為7.5 μmol/L時對PC3細胞增殖抑制效果最明顯。見圖1。

2.2Andro對PC3細胞增殖抑制作用的時間依賴性

用經7.5 μmol/L Andro處理的PC3細胞做細胞增殖時間梯度(0、24、48、72 h)檢測，結果顯示：與對照組相比，隨著作用時間的延長Andro對PC3細胞增殖抑制作用越明顯，且給藥48、72 h后抑制作用差異均有統計學意義(P<0.01)，見圖2。

120110100908070細胞增殖率/%*******12.51517.5012.557.510c(Andro)/(μmol?L-1)

與DMSO對照組比較：*P<0.05,**P<0.01。

圖1Andro處理濃度對PC3細胞增殖的影響

Figure 1Effect of andrographolide at different concentrations on the proliferation of PC3 cells

****7.5μmol/LAndroDMSO724824022020018016014012010080細胞增殖率/%t/h

與DMSO對照組比較：**P<0.01。

圖2Andro處理時間對PC3細胞增殖的影響

Figure 2Effect of andrographolide at different times on the proliferation of PC3 cells

2.3Andro對PC3細胞神經內分泌分化的抑制作用

結果見圖3，Andro治療PC3細胞后，神經內分泌分化標志物NSE和CgA蛋白的表達均顯著受到抑制；免疫印跡條帶灰度分析也顯示Andro組NSE和CgA蛋白的表達顯著低于DMSO對照組(P<0.01)。表明Andro具有抑制PC3細胞神經內分泌分化的作用。

NSECgAGAPDH蛋白相對表達量1.21.00.80.60.40.20.0DMSOAndroNSECgA****

與DMSO對照組比較：**P<0.01。

圖3Andro對PC3中神經內分泌標志物NSE、CgA相對表達量的影響

Figure 3Effect of andrographolide on the expression of neuroendocrine markers NSE and CgA in PC3 cells

3討論

Andro作為傳統中藥穿心蓮主要成分之一，其藥理作用雖被國內外學者廣泛研究，但尚未發現有抑制前列腺癌神經內分泌分化作用的報道。在臨床病理診斷中前列腺癌的神經內分泌化程度的標志物為神經元特異性稀醇化酶(NSE)和嗜鉻素A(CgA)。NSE是神經源性細胞分泌的一種蛋白酶，已有研究表明臨床神經內分泌腫瘤患者體內NSE的水平較正常人明顯增高，遂將其作為神經內分泌腫瘤的診斷指標之一，CgA是診斷神經內分泌腫瘤的重要標志物之一，且已廣泛用于多種神經內分泌腫瘤，如嗜鉻細胞瘤[11]、小細胞性肺癌[12]等的臨床病理診斷。因此，本研究選用NSE和CgA作為評價前列腺癌神經內分泌化程度的相關指標。

本研究以具有神經內分泌分化特性的人源性前列腺癌細胞株PC3為研究對象。文獻報道，前列腺癌細胞PC3具有神經內分泌癌特性[13]。通過MTT篩選實驗得出，Andro對PC3細胞增殖抑制的最佳效應濃度為7.5 μmol/L，然后以終濃度7.5 μmol/L的Andro處理細胞，通過MTT法檢測不同時間點Andro對PC3的增殖抑制率，同時，通過免疫蛋白印跡法檢測當Andro作用濃度為7.5 μmol/L時，NSE和CgA在PC3細胞中的表達情況。實驗結果顯示：Andro明顯地抑制前列腺癌細胞PC3的增殖，且抑制作用具有濃度與時間依賴性；同時，Andro下調了PC3中神經內分泌標志物NSE、CgA的表達。表明Andro具有抑制PC3細胞增殖和神經內分泌分化的作用，對具有神經內分泌化的前列腺癌有潛在的治療作用。但是，Andro抑制PC3細胞增殖及神經內分泌分化的作用機制仍需進一步研究探討。有文獻報道，Andro通過抑制NF-κB信號通路對胃癌[14]、鼻咽癌[15]、口腔癌[3]、胰島素瘤[4]、黑色素瘤[5]等癌細胞的增殖具有明顯的抑制作用。同時，有研究表明前列腺癌的神經內分泌分化作用與NF-κB信號通路的激活相關聯[16-17]。因此，Andro對前列腺癌神經內分泌化的抑制作用可能是通過抑制NF-κB信號通路實現的。總之，Andro抑制前列腺癌神經內分泌化的研究不僅為前列腺癌神經內分泌的臨床治療提供了新的可能，而且還為神經內分泌分化類腫瘤的藥物開發提供了新的方向。

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(責任編輯：幸建華)

Inhibition of andrographolide on the proliferation and neuroendocrine differentiation of prostate cancer cells

ZHOU Dalei1,ZHANG Qianqian1,LIU Hongying2,DUAN Youfa1,WANG Lijing1

(1.VascularBiologyResearchInstitute,SchoolofBasicSciences,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.TraditionalChineseMedicineHospitalofGuangdongProvince,Guangzhou510120,China)

Abstract:Objective To investigate the effect of andrographolide on the proliferation and neuroendocrine differentiation of prostate cancer PC3 cells. Methods After PC3 cells were treated with andrographolide,MTT method was used to detect the biggest effective concentration of andrographolide at 48 h and the time-dependent relationship at this concentration on PC3 cell proliferation. Meantime,western blot was employed to measure the expression of neuroendocrine differentiation markers NSE and CgA in PC3 cells. Results Andrographolide significantly inhibited the proliferation of PC3 cells at the dosage of 7.5 μmol/L in a time-dependent manner. The expression of NSE and CgA were decreased in PC3 cells when treated with andrographolide. Conclusion Andrographolide can inhibit the proliferation and neuroendocrine differentiation of PC3 cells.

Key words:andrographolide; prostate cancer; proliferation; neuroendocrine differentation

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015110601

中圖分類號:R285

文獻標志碼:A

文章編號:1006-8783(2016)01-0107-04

作者簡介：周大磊，男，2013級碩士研究生，Email：zhoudalei1234567@163.com；通信作者：王麗京(1962—)，女，博士，教授，主要從事腫瘤分子生物學以及血管生物學方面的研究，Email：wanglijing62@163.com。

基金項目：廣東省科技計劃項目(2015A030302083)；廣東省自然科學基金項目(2014A030313582)

收稿日期：2015-11-06

網絡出版時間：2016-01-12 9:52網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160112.0952.001.html