液相色譜-串聯質譜法檢查中藥制劑中非法添加那紅地那非化學成分的研究

隋　譯(雞西市食品藥品檢驗檢測中心食?；?，黑龍江 雞西　158100)

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液相色譜-串聯質譜法檢查中藥制劑中非法添加那紅地那非化學成分的研究

隋譯*(雞西市食品藥品檢驗檢測中心食?；遥邶埥?雞西158100)

DOI10.14009/j.issn.1672-2124.2016.02.019

摘要目的：采用液相色譜-串聯質譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)準確確證中藥制劑中非法添加那紅地那非化學成分的方法。方法：LC-MS/MS用理化反應法初篩成陽性的藥物后再應用，技術對四種可能有非法添加那非類化學藥品的中藥制劑進行篩查，與那紅地那非對照品的一二級質譜圖進行比較。結果：在樣品質譜圖中有與對照品一致的一級質譜峰與二級質譜峰。結論：應用LC-MS/MS法可快速準確鑒定出中藥制劑中是否含有非法添加的那紅地那非。

關鍵詞LC-MS/MS； 非法添加； 那紅地那非

Chemical Constituents of Hongdenafil Illegally Added in Traditional Chinese Preparation by LC-MS/MS Method

SUI Yi(Food, Health Care Product and Cosmetics Administration Room，Jixi Food and Drug Testing Center，Heilongjiang Jixi 158100，China)

ABSTRACTOBJECTIVE：High-performance liquid chromatography-mass spectrometry was adopted，method of traditional Chinese preparation was accurately confirmed. METRHODS：Physical and chemical reaction method was used to screening drugs in positive，and then LC-MS/MStechnology was used to screen 4 kinds of traditional Chinese preparation with illegal addition of hongdenafil；meanwhile，comparison was conducted between grade one and two spectrogram of control group and hongdenafil group. RESULTS：There were two peaks(grade one peak and grade two peak) in the mass spectrum of the sample that accorded with the control group. CONCLUSIONS：The application ofLC-MS/MStechnology can quickly and accurately identify if there is hongdenafil illegally added in traditional Chinese preparation.

KEYWORDSLC-MS/MS； Illegal addition； Hongdenafil

中藥對一些慢性病和疑難雜癥具有特殊療效且不良反應少，近年來很受患者的喜愛，但缺點是起效慢，服用時間長。在中藥制劑中擅自非法添加功效相似的化學藥物，成為不法分子牟取暴利的手段之一。在補腎壯陽類中藥制劑中，很多不法分子經常會添加那非類及他達拉非類化學成分，達到藥物起效快的效果。筆者先是按照標準[1]對選取的補腎壯陽類中藥制劑進行初步理化篩選試驗，再應用(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)法鑒定補腎壯陽類中藥制劑中非法添加的那非地那非。 LC-MS/MS聯用從保留時間和質譜行為兩方面判斷中藥中是否摻入了化學藥，質譜信息能提供豐富的化學結構信息，且方法便捷、準確，專屬性強，靈敏度高[2]。采用 LC-MS/MS法鑒定中藥制劑中非法添加的那紅地那非，可以更好的控制在消腫止痛類中成藥中的質量，保證臨床用藥。

1材料

1.1儀器

Agilent6430三重串聯四極桿液質聯用儀(美國安捷倫公司)。

1.2試劑

乙腈(賽默飛世爾科技(中國)有限公司，批號：124984)；乙酸銨(HNO3優級純)、乙酸(H2O2優級純)；試驗用水為超純水(屈臣氏蒸餾水)。

1.3藥品

1.3.1對照品：那紅地那非(中國藥品生物制品檢定所，批號：1097-037A3，含量：100%)。

1.3.2樣品：參茸三腎膠囊(吉林省俊宏藥業有限公司，批號：20130201)；壯腰健身丸(廣東省羅浮山白鶴制藥廠，批號：1401017，1307029，1401010，1401008，1401010，1404013)；壯腰健腎片(廣東逢春制藥有限公司，批號：140702)；補腎強身膠囊(吉林省健健今藥業股份有限公司，批號：20130303，20120305)。

1.4樣品處理

1.4.1樣品初篩的處理方法：取膠囊2粒(片劑1片；丸劑為每次服用量的1/5)，片劑、丸劑預先研細或剪碎后，加3%硫酸溶液8 ml，強力超聲5 min，靜置5 min后，濾過，取續濾液2 ml,滴加0.04 mol/L高錳酸鉀溶液，至溶液出現的紫紅色在15 s不褪色，靜置片刻后，帶紫紅色褪去至無色或淺棕色，滴加飽和的三硝基苯酚飽和溶液6滴，若3 min內出現黃色渾濁，靜置后形成黃色沉淀物，即為樣品中含有那非類化學成分。這10批樣中有3批出現陽性反應，證明里面含有那非類化學成分。本試驗就取這3批樣品進行最后的確證試驗。

1.4.2供試品溶液的制備：精密稱取1次服用量，研細后轉移至50 ml量瓶中，加乙腈40 ml，超聲處理20 min，冷至室溫用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。精密量取續濾液5 ml至25 ml容量瓶中，再精密量取續濾液5 ml至25 ml容量瓶中用50%乙腈稀釋，搖勻即得。

1.5對照品處理

對照品溶液的制備：取那紅地那非對照品10 mg，置50 ml容量瓶中，用乙腈溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取續濾液5 ml至25 ml容量瓶中，用50%乙腈稀釋，再精密量取續濾液5 ml至50 ml容量瓶中搖勻即得(稀釋制成每1 ml含4 μg 的溶液)。

1.6其他

所用玻璃器皿均以10%硝酸溶液浸泡24 h以上，用水反復沖洗，最后用超純水沖洗干凈，陰干備用。

2方法與結果

2.1儀器工作條件

2.1.1色譜條件：以十八烷基硅烷健合硅膠為填充劑；檢測波長為230 nm；以含0.05%乙酸的0.025 mol/L乙酸銨溶液∶乙腈溶液(V∶V=84∶16)為流動相A，甲醇為流動相B按下表1洗脫。

2.1.2質譜條件：電噴霧離子化源(ESI)，毛細管電壓5.5 KV，離子源溫度400 ℃，離子源噴霧氣流速800 ml/min,正離子檢測方式，掃描方式為全掃描一級質譜、全掃描二級質譜，掃描范圍50～600 amu。

表1　梯度洗脫的時間與各流動相之間的比例

2.2測定法

分別精密量取對照品溶液與供試品溶液各10 μl注入液質聯用儀，記錄液相色譜圖、一級質譜圖和二級質譜圖。采用比較供試品與對照品的一級質譜圖和二級質譜圖的方法進行定性、定量分析，確定供試品中添加的化學成分，見圖1。

2.3線性關系試驗

精密稱取那紅地那非對照品溶液(每1 ml含4 μg 的溶液)0.625、1.25、2.5、5.0、10.0 ml分別置50 ml量瓶中以流動相稀釋至刻度,精密量取各濃度對照品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以樣量濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，計算回歸方程為Y=4.2E+5X-5 773.3，r=0.999 2 結果進樣量在0.05～8.0 μg/ml時峰面積積分值呈良好的線性關系，見表2和圖2。

表2　線性關系表

2.4靈敏度試驗

圖1　LC-MS/MS法測定補腎壯陽類中藥制劑中非法添加那紅地那非化學成分的的一級質譜圖和二級質譜圖Fig 1　Grade one and two spectrogram of traditional Chinese preparation for reinforcing kidney to strengthen yang with application of LC-MS/MS technology

圖2　線性關系圖Fig 2　Linear relationship diagram

取對照品溶液“1.3.1”適量，加50%乙腈逐步稀釋，按“2.2.1”“2.2.2”項下條件測定，上述藥物的待測量在1～50 ng之間時，選擇離子監測(SIM)質譜峰信噪比(S/N)在3左右[3]。

2.5精密度試驗

在所選定測試條件下，以濃度為4 μg/ml的那紅地那非對照品溶液為考察對象，重復進樣6次進行精密度試驗，測得RSD=1.7%，表明該分析方法精密度良好。

2.6加樣回收率試驗

準確稱取樣品壯腰健腎丸(批號為：1401017)，3.5 g/份，共3份，按“1.2.2”項處理后，按“2.2.1”項條件檢測后，然后在樣品中按照低、中、高濃度分別加入標準樣品0.05、0.2、0.8 μg，做回收率試驗。結果表明樣品壯腰健腎丸加標回收率分別為100.05%、104.07%、101.15%，RSD為1.5 %。

2.7測定結果

中藥制劑中非法添加那紅地那非化學成分的測定分取研磨好的壯腰健身丸批號為：1401017，1307029，1401010，1401008共4份(n=4)按“1.2.2、1.3.1、2.2.1、2.1.2”的項下方法，測定編號為樣1、樣2、樣3、樣4的樣品中，結果比較供試品與對照品的色譜圖、一級質譜圖和二級質譜圖的方法進行定性分析，確定供試品中未添加的化學成分那紅地那非。

3討論

本研究中10批樣品，經過化學方法篩選，甄別出3批樣品含有黃色渾濁，靜置后有沉淀物生產。經過用液質聯用儀器分析后，證明該樣品中并未含有那紅地那非成分，應該是含有別的那非類成分，該試驗專屬性和針對性強，參考論文[4-17]，LC-MS/MS可以做為補腎壯陽類中藥制劑中含有那非類化學藥物例如那紅地那非，最后確證的試驗手段。

LC-MS/MS法是對藥物未知成分進行定性分析的有利手段。但是，當色譜分離效果差的時候會制約LC-MS/MS的分析效果。因此通常情況下，當兩個化合物未充分分離而形成部分重疊峰的時候，為了獲得明確的質譜信息，必須改變當前色譜條件以實現較充分的色譜分離[18]。在該試驗中原標準[1]使用的流動相進行了相應的調整，因為現在只是測定一種那非類物質，原標準中乙腈與甲醇還有乙酸銨溶液都單獨放在不用的流動相瓶中調比例進行梯度洗脫。筆者將乙腈與乙酸銨溶液互溶后在與甲醇按比例進行梯度洗脫后，在加樣回收試驗中可見該方法樣品質譜圖干擾小、更穩定，分離效果理想。

由于那紅地那非的出峰時間約為10 min左右，所以只單一測定那紅地那非的流動相洗脫時間參考那非類的對照品出峰時間可以相應縮短流動相時間。

由于該試驗是有標準物質的專屬試驗，結果判定則單從保留時間上，便可判定出樣品含不含有該物質，無需查看每個峰所對應的棒狀圖。在保留時間一致的情況下，則打出棒行圖進行碎片子離子的最后判定，會更直觀。

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(收稿日期：2015-07-08)

中圖分類號R943

文獻標志碼A

文章編號1672-2124(2016)02-0193-03

*副主任藥師。研究方向：藥品的質量控制和分析。E-mail:122502654@qq.com