維拉帕米聯合抗癌藥多西他賽對乳腺癌細胞抑制作用的研究

舒湘岑(孝感市中心醫院藥學部，湖北 孝感　432100)

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維拉帕米聯合抗癌藥多西他賽對乳腺癌細胞抑制作用的研究

舒湘岑*(孝感市中心醫院藥學部，湖北 孝感432100)

DOI10.14009/j.issn.1672-2124.2016.02.018

摘要目的：研究多西他賽與維拉帕米聯合應用對多藥耐藥的人乳腺癌MCF-7/ADR細胞的生長抑制作用。方法：采用噻唑藍(MTT)法測定藥物在體外對MCF-7/ADR細胞的抑制作用，計算半數致死量(IC50值)，并且應用金氏公式進行聯合用藥的效果分析，此外，還應用流式細胞分析技術進行細胞凋亡和細胞周期的分析。結果：多西他賽聯合維拉帕米治療對人乳腺癌MCF-7/ADR細胞有顯著的抑制作用， 抑制率與單一應用多西他賽相比提高了10倍，且IC50值為單獨用多西他賽的1/10。金氏公式顯示多西他賽與維拉帕米二者聯合具有協同作用，細胞周期和細胞凋亡的結果進一步證明二者聯用強于單一用藥。結論：維拉帕米可以逆轉乳腺癌細胞的多藥耐藥，其與多西他賽聯合用藥對乳腺癌細胞起到協同作用。

關鍵詞乳腺癌細胞； 多西他賽； 維拉帕米

Research on Inhibitory Effects of Verapamil Combined with Docetaxel on Breast Cancer Cells

SHU Xiangcen(Dept.of Pharmacy，Xiaogan Central Hospital，Hubei Xiaogan 432100，China)

ABSTRACTOBJECTIVE：To investigate the inhibitory effects of verapamil combined with docetaxel on human breast cancer cell MCF-7/ADR.METHODS：MTT assay was adopted to determine the inhibitory effects of verapamil combined with docetaxel on breast cancer cell MCF-7/ADR，IC50value was calculated，Jin’s formula was used to analyze the effect of drug combination therapy. Besides，the apoptosis and cell cycle were analyzed by flow cytometry. RESULTS：The inhibitory effects of verapamil combined with docetaxel in treatment of breast cancer cell MCF-7/ADR is significant， the inhibition ratio of was 10 times higher than that of single docetaxel，the IC50value was 1/10 of single docetaxel. According to Jin’s formula，verapamil combined with docetaxel had strong synergism effects. Moreover，the results of cell cycle and apoptosis also showed that verapamil combined with docetaxel had better effects than docetaxel or verapamil alone. CONCLUSIONS：Verapamil can reverse the multi-drug resistance of breast cancer cells，and when combined with docetaxel can gain the synergistic effects on breast cancer cells.

KEYWORDSHuman breast cancer cells； Docetaxel； Verapamil

隨著化療藥物的廣泛使用，腫瘤治療中的多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)問題顯得越來越突出，也是目前臨床腫瘤治療中的主要障礙和化療失敗的主要原因之一[1]。腫瘤MDR形成機制非常復雜，藥物外排蛋白P-糖蛋白(p-glycoprotein，P-gp)在細胞膜上的過度表達，是已經闡明的多種耐藥機理中的主要原因[2]。針對P-gp耐藥蛋白和耐藥機制，腫瘤MDR的逆轉策略主要體現在釆用載體給藥系統和多藥耐藥逆轉劑逆轉MDR。抗癌藥物多西他賽的抗癌譜廣，適用于多種惡性腫瘤的治療，但是MDR限制了其臨床應用[3-4]。維拉帕米是最早發現的具有逆轉腫瘤細胞MDR活性的逆轉劑，對多種化療藥物的MDR都有逆轉作用[5-6]。本研究探討維拉帕米和多西他賽共同使用對MDR的人乳腺癌MCF-7/ADR細胞的生長抑制作用，現報告如下。

1材料

1.1儀器與試藥

多西他賽(Docetaxel， 大連美侖生物技術公司)；維拉帕米(verapamil，上海禾豐制藥有限公司)；噻唑藍(Methylthiazo-lyldiphenyl-tetrazolium bromide，or Thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT，大連美侖生物技術有限公司)；RPMI-1640培養基(美國Gibco公司)；胰蛋白酶(美國Gibco公司)；胎牛血清 (杭州四季青生物公司)；碘化丙啶(PI， 美國Gibco公司)；CO2培養箱(德國Binder公司)、流式細胞(FACScan，Becton Dickinson，San Jose，CA)；680型酶標儀(BIO-RAD公司)；恒溫培養箱(RSBiotech公司)。

1.2細胞株及細胞培養條件

選用人乳腺癌MDR MCF-7/ADR細胞，其細胞表面的P-gp過度表達，且在體內外表現出MDR現象。細胞用含10%小牛血清RPMI1640培養基在37 ℃，含5%二氧化碳(CO2)的培養箱中培養，當細胞貼壁生長至較高密度時(80%～90%)，需要按照1：2或1：3的比例傳代，常采用酶消化法，消化液采用胰蛋白酶(0.25%，w/v)。具體步驟如下：將培養皿內的舊培養基以及漂浮的細胞碎片一同傾倒出去，然后用磷酸緩沖鹽(PBS)溶液洗細胞3次，加入適量胰蛋白酶，恰好將細胞覆蓋即可，置培養箱中孵育1～2 min，倒置顯微鏡下觀察，當細胞開始變圓，細胞間隙增大的時候，加入適量新鮮的含10%小牛血清RPMI1640培養液，輕輕反復吹打，使細胞混合均勻制成細胞懸液，離心5 min (1 000 rpm/min)，吸掉上清液，加入適量含血清的新鮮培養液，混勻后傳代，以正常培養條件培養[7]。

1.3統計學方法

本研究中數據采用SPSS 20.0統計學軟件進行分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2方法和結果

2.1細胞抑制率試驗

采用四甲基偶氮唑藍比色(MTT)法，分為4組，給藥方案如下：(1)空白對照組給予細胞培養液；(2)單用不同濃度的多西他賽溶液(1、5、10 μmol/L)；(3)單用不同濃度的維拉帕米溶液(1、5、10 μmol/L)；(4)多西他賽+維拉帕米，其中多西他賽和維拉帕米的濃度都為1、5、10 μmol/L。取對數生長期的MCF-7細胞和MCF-7/ADR細胞，分別用胰蛋白酶消化并收集細胞，用10%胎牛血清RPMI1640培養液將細胞稀釋成一定濃度的細胞懸液，將上述兩種細胞分別以6 000個/孔的密度接種在96孔培養板，將培養板移入CO2孵箱中，培養過夜貼壁后，按上述方案給予含藥培養液和對照液，每一濃度平行5孔，每孔體積200 μl，在常規培養條件下培養48 h后，每孔加5 mg/ml的MTT液15 μl，37 ℃繼續培養4 h后，棄上清液，每孔加100 μl的二甲基亞砜(DMSO)溶液，避光振蕩l0 min。選擇檢測為570 nm，在酶標儀上測定各孔吸光度值(A)[8]。按以下公式計算：細胞生長抑制率=(空白對照組平均A值-試驗組平均A值)/空白對照組平均A值×100%。并采用Logistic模型擬合量效關系，求半數抑制濃度IC50。

2.2聯合效果數據分析

評價藥物體外聯用細胞毒性作用是否具有協同作用，本研究采用金氏公式判斷[9-10]：Q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)，其中Ea+b是合并用藥抑制率，Ea和Eb分別是A藥和B藥的抑制率，公式中分子部分Ea+b代表“實測合并效應”，分母部分(Ea+Eb-Ea×Eb)代表“期望合并效應”。Q為兩者之比。當Q值為0.85～1.15時，兩藥作用為單純相加 (+)， 當Q值為1.15～2.0時，為增強 (++)，當Q值為0.85～0.55時，為拮抗 (-)，當Q值<0.55時，為明顯拮抗 (--)。

2.3細胞凋亡試驗

試驗分4組：(1)空白對照組：細胞培養液；(2)多西他賽組：多西他賽溶液；(3)維拉帕米組：維拉帕米溶液；(4)多西他賽+維拉帕米組：其中多西他賽和維拉帕米的濃度分別為為20 μmol/L和5 μmol/L。將對數生長期MCF-7/ADR細胞以6×105個/孔接種于6孔板中，貼壁培養24 h后，加入相應質量濃度的藥物進行培養，對照組加細胞培養液，培養48 h后，用0.25%胰酶將細胞消化，離心5 min (1 000 rpm/min)，棄去上清液，用PBS溶液清洗3次。然后用70%的冷乙醇固定4 h，離心3 min (1 000 rpm/min)，加入質量濃度為50 mg/ml的碘化丙啶(PI) 200 μl(終濃度為50 mg/l)，避光在培養箱中37 ℃放置約30 min后，加入PBS溶液400 μl，上機檢測用流式細胞儀檢測細胞周期，每組至少檢測1萬個細胞，每一濃度平行3次[11-12]。

2.4細胞周期

當細胞發生調亡時細胞周期各時相的百分比與正常細胞有所變化。因而，通過流式細胞儀分析各時期的細胞百分數，可檢測細胞的凋亡。將對數生長期MCF-7/ADR細胞以6×105個/孔接種于6孔板中，貼壁培養24 h后，加入相應質量濃度(5 μmol/L)的藥物進行培養，對照組加細胞培養液，培養24 h后，用PBS溶液洗滌2次，然后用70%的冷乙醇固定4 h，于4 ℃冰箱保存。取固定后的細胞，用PBS洗2次，加入脫氧核糖核酸酶和PI 200 μl(終濃度為50 mg/L)，4 ℃避光染色30 min，上機檢測。

2.5細胞抑制率試驗(MTT法)

表1顯示藥物對細胞的抑制率，對于維拉帕米溶液，在1～10 μmol/L的濃度范圍內，其對MCF-7/ADR細胞生長抑制效果比較微弱，可以忽略不計。即使在較高濃度10 μmol/L的條件下，其抑制濃度僅為(6.88±0.19)%。而多西他賽是一種抗癌藥，對乳腺癌細胞有一定的抑制作用，且對這種細胞生長抑制效果具有明顯的濃度依賴性。當溶度為10 μmol/L時，其抑制率達到了(19.25±0.47)%. 但是當多西他賽與維拉帕米兩種藥物合用后，其抑制率顯著增強，與單獨多西他賽相比，抑制率提高了10倍左右，可取得更好的細胞毒作用。根據金氏公式計算，兩種藥物的作用明顯增強，提示兩種藥物對于MCF-7/ADR細胞具有協同作用。

2.6藥物對MCF-7/ADR細胞的IC50值

藥物對MCF-7/ADR細胞的半數致死量能夠定量的表示藥物抗癌作用的強弱，具體的IC50值如表2所示，多西他賽、維拉帕米，多西他賽+維拉帕米三種不同的藥物樣品的IC50值分別為(26.04±0.59)、(80.12±1.24)、(2.26±0.16) μmol/L。MCF-7/ADR細胞對多西他賽溶液具有明顯的耐藥現象，而當多西他賽和維拉帕米溶液聯合給藥時，由于維拉帕米逆轉了乳腺癌細胞MCF-7/ADR的MDR，使多西他賽更好地發揮作用，顯著增強了其對細胞的抑制作用，IC50值是單一用多西他賽藥物的1/10。

2.7細胞凋亡

選擇多西他賽溶液濃度為20 μmol/L，維拉帕米濃度為5 μmol/L (該濃度具有明顯的逆轉P-gp引起的耐藥作用)進行細胞凋亡試驗。表3顯示藥物作用24 h后，多西他賽溶液可以輕微地使耐藥細胞MCF-7/ADR出現凋亡，而維拉帕米基本上不引起細胞的凋亡。當上述兩種藥物聯合使用后，細胞凋亡率明顯提高，高達65.98%。

2.8細胞周期

當細胞發生調亡時細胞周期各時相的百分比與正常細胞有所變化。因而，通過流式細胞儀分析各時期的細胞百分數，可檢測細胞的凋亡。細胞周期如表4所示，加藥各組的細胞凋亡率與空白對照組進行比較，單獨維拉帕米后對細胞各周期分布的影響差異無統計學意義(P>0.05)，這是由于維拉帕米對于細胞的抑制作用很微弱，基本不影響細胞周期的變化。多西他賽是細胞周期非特異性抑制的抗腫瘤藥，加入多西他賽之后，阻滯于G2/M 期的細胞明顯增多，差異有統計學意義(P<0.05)，使得處于G0/G1和S期的細胞有不同程度地減少，表明藥物通過抑制細胞的有絲分裂，進而延長細胞的有絲分裂期使細胞產生凋亡。多西他賽在合用維拉帕米后使得處于G2/M期的細胞與對照組相比顯著增多，細胞明顯被阻滯于G2/M期而逐漸凋亡，并且加用維拉帕米后處于G2/M期的細胞與多西他賽組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，提示兩藥對細胞周期的影響具有協同作用。

表1　藥物對MCF-7/ADR細胞作用24 h后的抑制率(%)

表2多西他賽和維拉帕米制劑對MCF-7/ADR細胞的

Tab 2　IC50 value of docetaxel combined with verapamil

Tab 3　Apoptosis of drugs on MCF-7/ADR cells

藥品凋亡率(FCM,%)多西他賽20μmol/L11.37±1.32維拉帕米20μmol/L2.49±0.07多西他賽20μmol/L+維拉帕米5μmol/L65.98±2.34

表4　藥物對MCF-7/ADR細胞作用24 h后的細胞周期變化

3討論

多西他賽是治療乳腺癌最有效的藥物之一，其在細胞內滯留時間長、濃度高，作為半合成的紫杉類抗腫瘤藥物，可以通過誘導小管聚合并抑制已形成微管束解聚，從而使微管束失去傳導功能，同時具有穩定性，進而阻斷腫瘤細胞的M與G2期，抑制其有絲分裂[13]。本研究將多西他賽在多藥耐藥的乳腺癌細胞MCF-7/ADR細胞上進行了細胞抑制率試驗，細胞周期和細胞凋亡試驗，由細胞抑制率試驗結果以、IC50以及金氏公式計算可以得知，與單獨多西他賽相比，當加入另一種藥物維拉帕米后，可明顯的恢復多西他賽濃度依賴性所引導的細胞毒性，可取得更好的細胞毒效果。而維拉帕米單獨對于細胞的抑制作用很微弱，基本不影響細胞周期的變化。這是由于MCF-7/ADR細胞表面過度表達P-gp，正是由于P-gp，使藥物多西他賽被P-gp泵出細胞，達不到一定的濃度，從而影響其治療作用[14]。而維拉帕米是第1代的P-gp抑制劑，可以抑制P-gp的泵出作用，隨著維拉帕米濃度的增大，其所逆轉耐藥作用也越來越明顯，其也能更好地發揮作用[15]。

通過細胞凋亡試驗進一步證實了多西他賽和維拉帕米具有協同作用。當細胞發生調亡時細胞周期各時相的百分比與正常細胞有所變化，因此通過細胞周期同樣可以分析抗癌藥物對癌細胞的抑制作用。維拉帕米對于細胞的抑制作用很微弱，基本不影響細胞周期的變化。多西他賽是細胞周期非特異性抑制的抗腫瘤藥，加入多西他賽之后，阻滯于G2/M 期的細胞明顯增多，而處于G0/G1和S期的細胞有不同程度地減少，藥其通過抑制細胞的有絲分裂，進而延長細胞的有絲分裂期使細胞產生凋亡。多西他賽在合用維拉帕米后使得處于G2/M期的細胞顯著增多，細胞明顯被阻滯于G2/M期而逐漸凋亡，這種現象同樣提示兩藥對細胞周期的影響具有協同作用。

需要注意的是，在治療過程中出現的MDR限制了多西他賽的療效。維拉帕米是第1代P-gp抑制劑，在過度表達的MDR腫瘤細胞中能夠逆轉耐藥現象。當兩種藥物聯合使用時，可以起到協同抑制腫瘤細胞的作用，效果顯著。

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(收稿日期：2015-06-23)

中圖分類號R979.1

文獻標志碼A

文章編號1672-2124(2016)02-0190-03

* 主管藥師。研究方向：醫院藥學。E-mail:759900603@qq.com