沙利度胺聯合表阿霉素對小鼠H22肝癌細胞增殖、侵襲與凋亡的影響

高軍，祝小英，石慶芳，王大慶，姜達(衡水哈勵遜國際和平醫院，河北衡水053000;河北醫科大學第四醫院)

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·基礎研究·

沙利度胺聯合表阿霉素對小鼠H22肝癌細胞增殖、侵襲與凋亡的影響

高軍1，祝小英1，石慶芳1，王大慶1，姜達2(1衡水哈勵遜國際和平醫院，河北衡水053000;2河北醫科大學第四醫院)

摘要：目的探討沙利度胺聯合表阿霉素對小鼠肝癌p2細胞的增殖、侵襲與凋亡的影響。方法 取處于對數生長期的小鼠p2肝癌細胞，隨機分為4組，分別加入生理鹽水(生理鹽水組)、沙利度胺50 μg/mL(沙利度胺組)、表阿霉素5 μg/mL(表阿霉素組)及沙利度胺50 μg/mL聯合表阿霉素5 μg/mL(聯合組)，采用MTT法檢測各組細胞增殖抑制率，侵襲實驗檢測細胞穿透數，并采用流式細胞儀測算各組細胞凋亡率。結果 聯合組p2細胞增殖抑制率、細胞凋亡率明顯高于另外三組(P均<0.05)，細胞穿透數顯著低于另外三組(P<0.05)。沙利度胺組細胞增殖抑制率、細胞凋亡率明顯低于表阿霉素組(P均<0.05)，細胞穿透數顯著高于表阿霉素組(P<0.05)。結論 沙利度胺能很好地協同表阿霉素抑制小鼠p2肝癌細胞的增殖及侵襲，并促進細胞凋亡。

關鍵詞：肝腫瘤；沙利度胺；表阿霉素;小鼠

肝癌發病率逐年增長，在我國居于第2位[1]。肝癌的發展速度快、轉移力強，臨床治療效果及預后欠佳[2]。沙利度胺是目前被證實的具有血管生成抑制作用的藥物，其曾因致畸作用而被禁用，但近年來發現其具有抗血管生成及免疫調節作用，大量研究發現其在胃癌、原發性肝癌及多發性骨髓瘤等治療中均有一定效果，并有相關研究證實其通過調節體內部分生長因子表達而發揮作用[3～5]。2009年6月～2013年9月，我們觀察了沙利度胺及表阿霉素干預后對小鼠p2肝癌細胞增殖、侵襲及凋亡的影響。

1材料與方法

1.1材料小鼠p2肝癌細胞株由河北醫科大學第四醫院提供，置于pH 7.2～7.4(含10%胎牛血清及2.5 mmol/L谷氨酰胺)DMEM/F12培養基(上海拜力生物科技)中，于37 ℃、5%CO2細胞培育箱中，飽和濕度條件下常規無菌培養，倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁生長良好，無退化，取對數生長期細胞進行實驗。沙利度胺片劑(江蘇常州制藥，國藥準字：h12026129)，研成粉末狀，懸于生理鹽水中配制混懸液；注射用鹽酸表阿霉素(輝瑞制藥，國藥準字：p0000496)，生理鹽水配制1 mg/mL實驗用液。MEM液(Chemicon公司)，Annexin V-FITC(R&D公司)，PI(R&D公司)，二甲基亞砜(Sigma公司)。酶聯免疫檢測儀(芬蘭Multiskan MK3)，流式細胞儀(美國Guava easyCyte 6-2L)。

1.2細胞增殖抑制率測算采用MTT法。取處于對數生長期的p2細胞，用0.25%胰酶(Sigma公司)消化后離心制備單細胞懸液，以每孔8.0×104/mL接種于96孔培養板中，200 μL/孔，加入培養液，邊緣孔加無菌PBS液，置于培養箱過夜。對照組加生理鹽水，沙利度胺及表阿霉素組分別加沙利度胺 50 μg/mL、表阿霉素 5 μg/mL，聯合組加沙利度胺 50 μg/mL、表阿霉素 5 μg/mL(沙利度胺、表阿霉素均溶于二甲基亞砜制備原液貯存待用)，每孔均為200 μL。37 ℃培養48 h時加入20 μL的MTT液(5 mg/mL)繼續培養4 h后出現結晶，吸去培養液加150 μL二甲基亞砜，搖床振蕩15 min，使用酶聯免疫檢測儀于570 nm處檢測溶液吸光度(OD值)，重復3次。細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.3細胞穿透數測算進行細胞侵襲實驗。Matrigel膠使用MEM液稀釋，取30 μL均勻包被Transwell小室，4 ℃過夜，收集對數生長期細胞，隨機分為對照組、沙利度胺組、表阿霉素組及聯合組，分別加入生理鹽水、沙利度胺、表阿霉素、沙利度胺+表阿霉素，劑量同前，用無血清MEM培養液重懸細胞后置入24孔板，上室加入5×103/200 μL無血清細胞懸液，下室加入500 μL的MEM培養液,37 ℃、5%CO2培養箱孵育24 h后，拭去基質膠及上室細胞，4%多聚甲醛固定下室細胞，染色后顯微鏡觀察，取5個不同視野計數穿透細胞數取均值，重復3次。

1.4細胞凋亡率測算取對數生長期p2細胞，常規胰酶消化，以4×105/mL接種至培養瓶，培養24 h后細胞貼壁生長吸去上清液，隨機分為對照組、沙利度胺組、表阿霉素組及聯合組，分別加入生理鹽水、沙利度胺、表阿霉素、沙利度胺+表阿霉素，劑量同前，繼續培養48 h。PBS液清洗離心2遍，再次消化，收集所有細胞，70%乙醇(4 ℃預冷)固定30 min，PBS沖洗后加入5 μL Annexin V-FITC及10 μL PI溶液混勻置于流式管中，室溫避光溴化丙啶1 mL染色30 min后使用流式細胞儀進行DNA定量，并依據細胞周期分布檢測并計算出細胞凋亡率。

2結果

2.1各組肝癌p2細胞增殖抑制率比較見表1。

2.2各組肝癌p2細胞穿透數比較對照組細胞貼壁生長良好，排列緊密，透亮度好，沙利度胺組、表阿霉素組及聯合組細胞均排列較稀疏，懸浮細胞增多，細胞皺縮明顯，胞核固縮，形態改變，遮光能力降低。各組肝癌p2細胞穿透數比較見表1。

2.3各組肝癌p2細胞凋亡率比較見表1。

注：與生理鹽水組比較，*P<0.05；與表阿霉素組比較，△P<0.05；與聯合組比較，○P<0.05。

3討論

沙利度胺最初作為鎮靜藥物應用于臨床，近年研究證實其具有抗血管生成及免疫調節作用。潘驥群等[6]研究發現其具有抑制bFGF及VEGF表達的作用，并提出沙利度胺具有抗血管生成作用。表阿霉素屬于抗生素類抗腫瘤藥物，其可干擾轉錄過程，從而抑制DNA及RNA合成，對多種實性腫瘤均有良好效果[7]。

浸潤和轉移是惡性腫瘤的重要特征，通過抑制血管增生來控制腫瘤的發展是一種有效的方法。腫瘤細胞的快速成長有賴于新生血管的形成，并同時通過新生血管形成腫瘤細胞的轉移途徑[8]。與傳統抗腫瘤治療相比，抗血管生成治療具有起效快、不易產生耐藥性的優勢。因此針對新生血管的靶向治療成為近年抗腫瘤治療的熱點[9]。

本研究我們發現，沙利度胺聯合表阿霉素對小鼠p2肝癌細胞增殖抑制較強，且在侵襲實驗中發現兩藥聯用能顯著降低腫瘤細胞的穿透數，且流式細胞檢測證實聯合用藥能促進腫瘤細胞凋亡，因此，沙利度胺聯合表阿霉素能對小鼠p2肝癌細胞生長起到明顯抑制作用。本研究發現，沙利度胺作用后肝癌細胞DNA直方圖G1期峰前出現細胞凋亡峰亞G1期，揭示沙利度胺能很好地協助表阿霉素抑制小鼠p2肝癌細胞的增殖及侵襲，并促進細胞凋亡，誘導細胞凋亡可能為其抑制肝癌細胞的作用機制之一，王喜安等[10]研究發現沙利度胺治療小鼠HAC能明顯降低瘤重，抑瘤率為50.1%。

目前諸多實驗證實沙利度胺聯合某種化療藥物可達到良好的協同作用，較藥物單用效果明顯。其抗腫瘤作用可能通過抑制腫瘤細胞DNA、RNA的合成，直接殺傷腫瘤細胞；兩藥聯用，一方面抑制腫瘤細胞本身的分裂增生，另一方面抑制腫瘤新生血管形成，減少瘤體營養供應，產生較好的腫瘤抑制效應。

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基金項目：衡水市科學技術研究與發展指導計劃項目(09021Z)。

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.13.008

中圖分類號：R735.7

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)13-0023-02

(收稿日期：2015-10-28)