循環腫瘤細胞檢測在乳腺癌療效評價和預后判斷中的研究進展

徐細明，陳嘉羽,，蒿艷蓉，周宇杰，梁慧玲

(1武漢大學人民醫院，武漢430060;2廣西壯族自治區人民醫院)

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循環腫瘤細胞檢測在乳腺癌療效評價和預后判斷中的研究進展

徐細明1，陳嘉羽1,2，蒿艷蓉2，周宇杰1，梁慧玲1

(1武漢大學人民醫院，武漢430060;2廣西壯族自治區人民醫院)

腫瘤細胞自原發灶脫落，直接或經淋巴系統間接進入血循環系統進而在遠處組織、器官增殖，最終形成轉移灶，這部分脫落進入循環系統的腫瘤細胞即被稱之為循環腫瘤細胞(CTC)。近年來乳腺癌中CTC檢測受到越來越多關注，其被認為在治療方案的選擇、評估對治療的反應及預后上有很大前景。CTC檢測可發現有高危復發風險和轉移的早期乳腺癌患者。

乳腺癌；循環腫瘤細胞；CellSearch 技術

乳腺癌是女性惡性腫瘤中最常見的腫瘤，亦是世界上癌癥死亡的主要原因之一[1]。幾乎所有乳腺癌相關的死亡均系遠處轉移而非原位復發[2]。近年來有臨床試驗研究發現，檢測患者外周血循環腫瘤細胞(CTC)在乳腺癌早期診斷、疾病進展和預后判斷及療效實時監測等方面均有重要參考價值。腫瘤細胞自原發灶脫落，直接或經淋巴系統間接進入血循環系統進而在遠處組織、器官增殖，最終形成轉移灶，這部分脫落進入循環系統的腫瘤細胞即被稱之為CTC。雖然CTC計數不斷地被臨床腫瘤醫師使用，但針對CTC計數的最佳使用方法目前尚無明確指南。現就CTC在乳腺癌療效評價和預后判斷中的研究進展綜述如下。

1 CTC檢測方法及原理

目前絕大多數非干預性研究使用CellSearch系統進行CTC檢測，這是一種使用最普遍的檢測方法。CellSearch系統是目前惟一被美國食品藥品監督管理署(FDA)批準進入臨床的檢測方法，用于預測轉移性乳腺癌、前列腺癌和結直腸癌的無進展生存時間(PFS)和總存活時間(OS)，因此其常當作金標準來進行討論與比較[3]。CellSearch計數法通過強力磁體將上皮黏附因子(EpCAM)陽性的CTC從血樣本中富集出來，證明其為上皮來源的細胞，然后通過對細胞角蛋白(CK8、CK18、CK19、CD45 和DAPI進行免疫熒光染色，證明其為非白細胞及有核細胞，系統掃描分析后篩選CK+的細胞供檢測判讀，符合腫瘤細胞形態且CK+、DAPI+、CD45-的細胞被定義為CTC。CellSearch 系統目前被認為是精確度較高的一種檢測方法，能在7.5 mL全血中穩定地檢測出至少一個CTC[4，5]。

2 CTC檢測在早期乳腺癌治療效果及預后評估中的作用

早期乳腺癌患者進行局部治療的方案由遠處轉移風險的高低決定。有高復發風險的早期患者要進行新輔助或輔助治療。復發風險的評估目前基于多個經典臨床病理因素，包括患者特征(如年齡偏小)，原發瘤特征(如腫瘤較大、Bloom-Richardson分級系統呈高級別、存在淋巴結轉移)。另外，雌激素受體(ER)的表達和HER2基因的擴增在預測因子中至關重要。在表達ER和HER2受體的乳腺癌患者中進行內分泌和抗HER2治療會大幅度地降低乳腺癌復發率[6,7]。然而，后續輔助治療對15年內乳腺癌病死率的改善一直穩定在3%～10%[9]。上述研究說明諸多患者接受了無效治療，使其不必要地增加了毒性，對短期和長期的生活質量造成了損傷。上述研究明確強調了我們需對早期乳腺癌進行預后評估，避免早期乳腺癌的過度治療。在早期乳腺癌中，CTC檢測的潛在應用包括識別有低度遠處轉移風險的患者，這些患者可免去輔助系統治療，或者有高度遠處轉移風險的患者，這些患者需強化圍手術期的系統治療。此外，CTC數目變化可被用來評估對治療的反應，能在治療的早期階段識別對治療無反應的患者，并更換方案。

2.1 CTC檢測在新輔助化療早期乳腺癌效果及預后評估中的作用 新輔助化療是被診斷為早期乳腺癌的患者通過化療縮小腫瘤，使能進行保乳手術或乳腺根治術[8]。術前明確要進行輔助化療的患者可考慮新輔助化療，新輔助化療目前已漸變成標準治療方案。Rovati等[9]將118例患者納入研究，分別測定其新輔助化療前后的CTC檢測，結果顯示，化療前后CTC的變化與病理性完全緩解(pCR)、腫瘤大小、淋巴結情況及腫瘤分級不相關，化療前后均無CTC的患者相對于檢測出CTC的患者，會有較長的無遠處轉移生存期。

CTC檢測可能對HER2陽性接受了曲妥珠單抗治療的患者的預后價值不高[10]。在BEVERLY-2研究中我們對52例HER2陽性的炎性乳腺癌患者進行了評估，這些患者使用的是以貝伐珠單抗為基礎的新輔助化療方案[11]。同其他研究一樣，CTC數目與病理性完全緩解(pCR)無關。而最近一篇包含3年隨訪數據的綜述表明基線時CTC的數目是與無病生存時間(DFS)相關的獨立預后因子[12]。

總之，目前新輔助化療前后的CTC檢測用來評估預后的相關文獻還無完全說服力。盡管REMAGUS02研究認為檢測出CTC可能預示有更差的OS，BEVERLY2研究數據顯示HER2陽性的炎性乳腺癌患者中檢測出CTC預示更差的DFS，我們還需大量、更具權威性、擁有更長隨訪時間的研究來證明這種相關性的存在。

2.2 CTC檢測在輔助治療早期乳腺癌效果及預后評估中的作用 多項小型研究表明，早期乳腺癌手術前發現CTC可能預示早期復發或OS的降低[13～16]。目前為止最大的研究是SUCCESS實驗，該實驗納入了2 026例患者評估輔助治療前后CTC的預后價值[17]。

在SUCCESS實驗中，輔助治療前檢測出至少1個CTC預示著會有更差的DFS(HR2.11, 95%CI1.49～2.99) 和OS (HR2.18, 95%CI1.32～3.59)。有淋巴結轉移的患者更易檢測出CTC。對亞組的結果進行分析發現， 輔助治療前檢測出CTC對淋巴結陰性患者的DFS無預測作用，這與淋巴結陽性的患者是相反的結果，淋巴結陽性的患者中檢測出CTC預示更差的預后。化療前后未檢測出CTC的患者有更好的3年DFS和OS，分別為94.2%和97.6%。與那些化療前或/和化療后未檢測出CTC的亞組比較，化療后仍持續存在CTC其3年DFS更短(85.9%)，但OS只是有下降的趨勢(HR1.16, 95%CI0.99～1.37)。值得注意的是有17%的患者化療前未出現CTC，而化療后出現。這些患者3年DFS為94.9%，與那些持續陰性的患者相比其3年DFS相似，說明化療后CTC由陰性轉陽并不能說明結局會較差。相比之下，化療后由陽轉陰的患者卻有更差的3年DFS(91.1%)。

3 CTC檢測在轉移性乳腺癌(MBC)預后評估中的作用

Cristofanilli等[18]研究顯示，7.5 mL外周血中CTC≥5個表示預后不佳。CTC≥5的患者里，中位無進展生存期(PFS)為2.7個月，而CTC<5的患者PFS為7個月，且中位OS更短(10.1個月 vs.>18個月)。這篇文章發表10年后，第1篇評估基線狀態下和治療過程中CTC檢測臨床有效性的合并分析由Bidard等[19]發表。該研究納入的MBC患者，開始新的治療方案，且至少接受CTC基線評價并對PFS和OS進行隨訪。這項研究證實了Cristofanilli等[18]的研究成果。基線狀態下，CTC≥5的患者中位PFS(6.5 vs11.4 個月)和OS(15.5 vs 37.1 個月)要更短。此外，3～5周治療后CTC數目變化被作為評估治療反應的潛在標志。基線狀態下CTC<5且治療過程中保持穩定(<5 CTC)的患者預后最好，中位OS達41.5個月。治療前CTC≥5治療后<5的患者與治療后≥5的患者相比，其OS更好(13.1 個月 vs 27.0 個月)。最后一個發現認為基線下CTC<5的患者沒必要監測CTC變化。總之，這篇大型分析提供了CTC檢測作為MBC中各線治療方案的預后指標其臨床有效性的A級證據。Jiang等[20]進行的前瞻性、雙盲、多中心實驗，研究發現CTC在健康受試者和良性腫瘤病變中檢出稀少且檢測結果≤2，而在轉移性乳腺癌中391%檢出CTC≥5，CTC水平與轉移部位、激素受體狀態及HER2狀態相關。

雖然CTC數目變化與MBC預后相關，但尚不明確如果患者CTC檢測在治療期間未下降到<5就表明治療失敗需更換治療方案的這種做法是否會獲益。在2014年由Smerage等[21]發表的首個干預性實驗，即SWOGS0500實驗該實驗運用CTC檢測并強調了這個問題。該研究對595例患者進行初始篩查后，有288例治療前CTC≥5的MBC患者在經過3周的一線化療后再次進行評估，123例患者CTC始終≥5，這些患者隨機分為C1組和C2組，C1組維持一線化療，C2組更換二線方案。令人失望的是兩組間PFS或OS無統計學差異。可見更換治療方案在預后差的患者中似乎無明顯獲益。我們推測其原因可能是MBC的一線化療和二線化療方案間存在某種一般化學耐藥或交叉耐藥,其潛在的機制有待研究。

4 CTC檢測在乳腺癌療效評價中的作用

除研究CTC對預后的影響，我們進一步評估和確立了CTC檢測與傳統檢測手段相比，如血清學腫瘤標記物和影像學檢查，其在監測腫瘤負荷及治療效果上的地位。血清腫瘤標記物常被用來監測轉移性乳腺癌患者的腫瘤負荷和治療療效。2013年ESO指南[19]提倡僅利用癌抗原15-3(CA15-3),癌胚抗原(CEA)和癌抗原27.29(CA27.29)聯合影像學和患者特征來對MBC的臨床治療方案進行制定。當轉移病灶不能充分地進行測量，如部分患者僅出現骨轉移時，這3種腫瘤標記物可作為惟一的參數來進行方案調整。Bidard等[19]還將CEA、CA15-3與CTC檢測的臨床價值進行對比，證實MBC治療前，原發腫瘤特征、先前的治療情況、無轉移間期、轉移部位、年齡及體力狀態，這些臨床病理參數聯合CTC檢測是與OS相關的最強有力模式。而在最強基線模式上再加入CEA和CA15-3的變化情況并未對預測OS有更好的效果。而加入CTC的變化則能更好地預測OS。這些結果說明MBC治療前和治療過程中監測CTC是優于血清腫瘤標記物的。血清腫瘤標記物目前是用評估不可測量轉移病灶治療療效的臨床標準，如僅發生骨轉移的患者，可考慮進行CTC監測，來代替對血清腫瘤標記物的監測。

影像學是MBC患者療效評價的基礎。目前臨床試驗廣泛采用RECIST[22]指南進行療效評價。Budd等[23]將MBC患者的CTC檢測與CT掃描與OS的相關性比較。CTC分別在基線狀態下和治療4周后進行檢測，影像學則每9～12周進行療效評價。研究表明，4周后CTC<5，且影像學療效評價判斷為穩定(SD)或部分緩解(PD)的患者中位OS最長，為26.9個月。影像學判斷為進展(PD)根據CTC檢測的不同，預后差異大：對于影像學PD而CTC<5的患者而言，中位OS為19.9個月；而影像學PD且CTC≥5的患者中位OS為6.4個月。而研究表明De Giorg等[24]，對比CTC與運用18氟-脫氧葡萄糖正電子發射計算機斷層顯像(FDG-PET/CT)來進行影像學療效評估，其結果與Budd 等研究結果相似。這項研究證實，中期治療的CTC檢測是與OS相關的最重要因子，獨立于FDG-PET/CT的中期治療療效評價。這些研究表明，CTC可用作早期臨床療效評價的終點，可替代或聯合影像學評估。另外，這些研究亦表明，基于CTC檢測來改變治療方案可能比影像學更好。Pierga等[25]對115例患者進行回顧性分析發現，如果治療期間CTC≥5，CTC可作為評估預后的指標；在治療期間CTC<5的患者，PET/CT則可作為評估預后的指標。CTC檢測作為標準的影像學檢測手段之外的輔助評估方法，其優勢是能更早地判斷疾病進展，為患者及時調整治療方案提供更多幫助。

綜上所述，CTC檢測被認為是個性化乳腺癌治療的重要保證，目前為止，早期乳腺癌的CTC檢測還未取得真正的臨床價值。相反，最近Bidard等[19]對CTC檢測在MBC中的臨床應用價值提供了A級證據。然而，其臨床有效性并不能在臨床真正應用。Smerage等[21]實驗則證實，治療期間CTC仍≥5的MBC患者改變治療方案并無更好的獲益。

SWOG干預實驗證實，有兩種情況推薦應用CTC檢測。第一種情況在MBC中CTC優于血清學腫瘤標記物，并明確表明在不可測量的病灶中，如僅有骨轉移的患者，CTC應更多用于監測腫瘤進展及對治療的反應情況。第二種情況CTC檢測是評價MBC治療反應情況的可靠方法，且早期CTC數目的變化、治療4～6周后CTC檢測，與臨床相關終點(包括PFS和OS)強烈相關。CTC作為早期療效指標在早期臨床試驗中，如Ⅰ期或Ⅱ期研究中，被推薦用來替代或加入到影像學療效評估中。SWOG S0500研究表明，轉移的患者CTC持續增長≥5可能存在一般化療耐藥，重復進行CTC檢測對治療療效做出評價，可能會為患者找到合適的治療藥物。目前國際上尚無統一的CTCHER2陽性判定標準。雖然目前有關于CTC表面HER2陽性的患者可能從曲妥珠治療中獲益臨床研究，但仍處于初期階段[26]，且目前國際上尚無統一的CTCHER2陽性判定標準。

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蒿艷蓉(E-mail：282174944@qq.com)

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2016-06-12)