結直腸癌患者外周血LAP+CD4+調節性T細胞的分離純化及功能鑒定

陽祖慶,江志遠,鐘武,王時俊,曹云飛

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021)

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結直腸癌患者外周血LAP+CD4+調節性T細胞的分離純化及功能鑒定

陽祖慶,江志遠,鐘武,王時俊,曹云飛

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021)

目的 應用免疫磁珠分選法分離純化結直腸癌患者外周血中LAP+CD4+調節性T細胞(LAP+CD4+T)，并對分選獲得的目的細胞進行體外功能的初步研究。方法 按照免疫磁珠兩步法(陰性分選和陽性分選)分離結直腸癌患者外周血單個核細胞中的LAP+CD4+T細胞，流式細胞術(FACS)檢測分選后細胞的純度；臺盼藍染色檢測細胞存活率；CCK-8摻入法檢測其對LAP-CD4+T細胞的增殖抑制效應；ELISA法檢測體外細胞因子TGF-β和IL-10表達。結果 經免疫磁珠法分選獲得的LAP+CD4+T細胞純度為(95.16±2.11)%，臺盼藍染色細胞存活率為(93.64±1.33)%。CCK-8摻入法檢測結果顯示LAP+CD4+T細胞干預后LAP-CD4+T細胞生長明顯受到抑制(P=0.000)；ELISA結果顯示LAP+CD4+T細胞較LAP-CD4+T細胞分泌更高濃度的細胞抑制因子TGF-β和IL-10(P=0.000)。結論 免疫磁珠法分選結直腸患者外周血中LAP+CD4+T細胞具有高效、快捷、純度高等優點，且不損傷細胞活性。

結直腸癌；免疫磁珠法；LAP+CD4+調節性T細胞

結直腸癌(CRC)是胃腸道疾病中常見的惡性腫瘤，美國國家癌癥協會2014年最新數據顯示，CRC的發病率和病死率排在常見致死性惡性腫瘤疾病的第三位[1]。目前我國CRC病死率排在惡性腫瘤死亡疾病的第五位[2]。CRC的惡性增殖與機體免疫功能下降及腫瘤細胞的免疫逃逸分不開[3,4]。已有研究結果顯示調節性T淋巴細胞可富集到胃癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤患者的外周血及其腫瘤組織中，提示其可能參與胃癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤細胞的免疫逃逸[3～5]，并且在腫瘤的發生和發展過程中發揮重要作用。LAP+CD4+調節性T細胞(LAP+CD4+T)是新近發現不同于傳統調節性T細胞的新型CD4+T細胞亞群，體內外實驗[6]證實其與多種自身免疫性疾病的發生、發展及預后相關，且較傳統調節性T細胞有更強的免疫抑制功能，但其在CRC中的發病機制尚不明確。因此如何從CRC患者外周血中簡便、快速分離出高純度LAP+CD4+T細胞，對今后研究LAP+CD4+T細胞將有重要意義。本研究旨在探索一種能用于體外分離和純化CRC患者外周血LAP+CD4+T細胞的方法，為LAP+CD4+T細胞在CRC臨床及基礎研究中提供幫助。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年6月～2015年1月廣西醫科大學附屬第一醫院結直腸肛門外科新入院經病理診斷為CRC患者27例，男11例、女16例，年齡32～70歲，平均52歲。患者術前均未接受任何化學或放射治療及免疫治療，且術前檢查均排除自身免疫性及感染性疾病。本研究均符合人體實驗倫理學標準，獲本院倫理委員會批準及所有受試者本人同意。

1.2 單個核細胞懸液的制備 抽取患者新鮮外周血6 mL并緩慢加入裝有6 mL Ficoll-hypaque淋巴細胞分離液的15 mL無菌離心管中，2 500 r/min，離心30 min，吸取中間云霧狀細胞，即為外周血單個核細胞(PBMC)，用經高壓滅菌的PBS液洗滌2次，再以含1%胎牛血清(PBS)液重懸細胞，調整濃度至5×107/mL，至少取1 mL細胞懸液置于10 mL無菌離心管中用于磁珠分選實驗。

1.3 磁珠陰性CD4+T細胞分選 將單個核細胞懸液按1×105/mL 比例放于5 mL的聚乙烯試管中。按50 μL/mL 加入 Easysep Human CD4+T Cell enrichment cocktail混勻，室溫(15～25 ℃)孵育10 min。再加入含抗生物素標記的磁珠混勻后避光室溫孵育10 min。Buffer洗滌后1 500 r/min，離心5 min棄上清液，沉淀用1 mL Buffer重懸。將MS柱置于MACS分選系統中MPC架上，用2 mL Buffer過柱，然后將細胞懸液加入柱內，再用1 mL Buffer洗柱并收集從分選柱中流出的細胞。取少量細胞加入抗CD4-FITC標記的抗體，用流式細胞儀分析CD4+T 細胞的純度。

1.4 磁珠陽性LAP+CD4+T細胞分選 將CD4+T細胞懸液調整至0.5×105/mL，900 μL Buffer重懸，加入100 μL Easysep Positive selection cocktail室溫孵育15 min，再加入50 μL Easysep SA 磁性微粒避光室溫孵育15 min。將MS柱置于MACS分選系統中MPC架上，1 mL Buffer過柱，然后將重懸的細胞液加入柱內，用1 mL Buffer洗柱，收獲流下來的液體即為LAP-CD4+T細胞，然后將MS柱移開磁場放入一個無菌收集管中，快速向柱中加入1 mL Buffer并用活塞將磁珠標記的LAP+CD4+T細胞沖出柱子。Buffer洗滌2次，沉淀用1 mL Buffer重懸，分別取少量細胞懸液加入抗LAP-PE標記(LAP)潛肽相關多肽的抗體后用流式細胞儀分析 LAP+CD4+T細胞及LAP-CD4+T細胞的純度。另外分別留取LAP+CD4+T細胞和LAP-CD4+T細胞進行增殖抑制試驗。

1.5 LAP+CD4+T細胞活性和抑制功能的鑒定 取15 μL細胞懸液用4 g/L的臺盼藍染料進行染色，按照細胞存活率=染色陰性細胞數/細胞總數×100%，觀察并計算細胞存活率。分別選取陽性分選的LAP+CD4+T細胞和陽性分選時收集的LAP-CD4+T細胞各0.5×105，按1∶1比例共同培養于經人CD3、CD28單抗包被的96孔板中，另外設置兩個對照組(即LAP+CD4+T細胞、LAP-CD4+T細胞單獨培養)，并設置復孔，每孔添加IL-2 200 U。細胞培養于5% CO2、37 ℃恒溫箱中48 h，在培養結束前3 h每孔加入CCK-8 10 μL，在酶標儀450 nm波長處檢測并記錄每孔細胞的OD值，繪制細胞增殖曲線。

1.6 細胞因子的初步檢測 分別取單獨培養48 h后的LAP+CD4+T細胞和LAP-CD4+T細胞上清液20 μL，應用ELISA試劑盒按照操作說明檢測細胞因子TGF-β、IL-10含量，并根據Curve Exper軟件所制作出來的標準曲線計算相應的細胞因子濃度。

1.7 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，不服從正態分布時采用秩和檢驗，方差不齊時采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫磁珠分選后的細胞純度 經免疫磁珠陰性分選獲得的CD4+T細胞的純度為(93.57±1.87)%，陽性分選后LAP+CD4+T細胞的純度為(95.16±2.11)%，LAP-CD4+T細胞純度為(96.33±2.28)%。見圖1。免疫磁珠分選技術可獲得較高純度的目的細胞，可用于下一步功能鑒定實驗。

2.2 免疫磁珠分選的細胞活性CD4+T細胞分選前的細胞活性為(95.28±1.17)%，經免疫磁珠兩步法分選后獲得的LAP+CD4+T細胞活性為(93.64±1.33)%，二者比較差異無統計學意義(t=-3.021，P=0.172)。LAP-CD4+T細胞活性為(94.05±1.41)%，與分選前的CD4+T細胞活性相比差異無統計學意義(t=-1.339，P=0.189)。臺盼藍染色實驗結果提示細胞在分選前后均保持良好的活性，免疫磁珠分選過程不影響細胞的活性。

2.3 細胞培養結果LAP+CD4+T細胞單獨培養OD值為0.35±0.14，LAP-CD4+T細胞單獨培養OD值為0.79±0.22，兩者相比差異有統計學意義(t=-7.631，P=0.000)；提示LAP+CD4+T細胞具有免疫無反應性。與LAP+CD4+T細胞單獨培養相比，混合培養OD值為0.39±0.18，二者比較差異有統計學意義(t=-7.914，P=0.000)；提示LAP+CD4+T細胞對LAP-CD4+T細胞有明顯抑制作用。

2.4LAP+CD4+T細胞因子IL-10和TGF-β表達比較ELISA檢測結果顯示LAP+CD4+T細胞高表達免疫抑制細胞因子，IL-10和TGF-β分別為(149.32±22.68)、(182.22±63.44)ng/mL，LAP-CD4+T細胞高表達免疫抑制細胞因子，IL-10和TGF-β分別為(78.52±22.38)、(113.83±29.96)ng/mL，二者同一指標比較，P均<0.05。

3 討論

潛在性相關多肽[7]是一種能與TGF-β非共價結合的前肽，其結合于TGF-β的氨基末端并形成小的潛在TGF-β復合物。目前在小鼠模型及健康人體內均發現膜結合型TGF-β和分泌型TGF-β，體外研究實驗[6]表明Treg細胞的分化及免疫抑制功能與TGF-β緊密相關。2010年Grandhi等[8]發現在健康人外周血中存在LAP+CD4+Treg細胞，這些細胞具有低增殖性且缺乏Foxp3，能分泌IL-8、IL-9、IL-10及干擾素-γ，其免疫抑制活性依賴TGF-β和IL-10。IL-10是一種重要的抗炎因子，能分泌跨膜受體復合物，調節多種免疫細胞的功能活性,進而減少炎性介質的釋放，抑制炎性細胞的增殖和遷移進而緩解急慢性炎癥癥狀[12]。最近研究[9,10]表明，IL-10能不同程度地抑制CD4+T細胞增殖及細胞因子合成，且與多種腫瘤的預后相關。TGF-β對細胞的生長分化及機體免疫功能的調節均有重要作用，可能通過以下機制促進腫瘤生長：一方面TGF-β能抑制中性粒細胞、T淋巴細胞、自然殺傷細胞等免疫性細胞因子的產生從而抑制免疫細胞的增殖、分化及其活化[11]；另一方面TGF-β通過激活絲裂原活化蛋白激酶通路(MAPK)促進腫瘤內血管的生成繼而促進腫瘤在體內的生長[12]。

LAP+CD4+T細胞作為一種新近發現的Treg細胞亞群在疾病中的作用受到越來越多的關注。現有研究[13,14]證明，LAP+CD4+T細胞能緩解紅斑狼瘡、糖尿病等自身炎性疾病動物模型的癥狀。Mahalingam等[15]研究發現CRC患者腫瘤組織中LAP+CD4+T細胞明顯高于癌旁組織；該細胞易于富集到腫瘤組織中，可能參與了這里的免疫逃逸機制。這些細胞能高表達INF-γ、IL-17，相對低水平的IL-2及IL-10；對LAP-CD4+T細胞的抑制作用部分依賴TGF-β。因此想要進一步揭示LAP+CD4+T細胞功能在自身免疫性疾病和腫瘤免疫機制中的作用，就需得到一群純度高、活力好的LAP+CD4+T細胞來研究。現今，分離LAP+CD4+T細胞主要方式有流式細胞分選法和免疫磁珠分選法，流式細胞分選法由于對實驗儀器設備要求高且操作復雜成本較高，不適合廣泛推廣。而基于免疫吸附原理的免疫磁珠分選法具有高效、快速、操作簡單的優點，短時間內能獲取高純度的LAP+CD4+T細胞。本實驗采用免疫磁珠法從結直腸癌患者外周血中分離出來的CD4+T細胞純度為(95.16±2.11)%，LAP-CD4+T細胞純度為(96.33±2.28)%，臺盼藍染色實驗顯示分選后細胞活性較分選前細胞活性差異無統計學意義。說明免疫磁珠法分離LAP+CD4+T細胞對細胞活性影響很小，能滿足下一步實驗研究需要。ELISA實驗結果顯示，LAP+CD4+T細胞與LAP-CD4+T細胞比較，前者分泌較多TGF-β和IL-10，此與Grandhi等[8]有關LAP+CD4+T細胞的體外細胞因子譜的表達結果相似；說明LAP+CD4+T細胞有可能通過分泌大量免疫抑制因子繼而抑制宿主對腫瘤的免疫應答，另外LAP+CD4+T細胞單獨培養OD值明顯低于LAP-CD4+T細胞單獨培養，差異有統計學意義；說明LAP+CD4+T細胞具有較低的免疫反應性；混合培養OD值相較于LAP+CD4+T細胞單獨培養的OD值差異有統計學意義；說明LAP+CD4+T細胞對LAP-CD4+T細胞有明顯抑制作用，這與Mahalingam等[15]關于LAP+CD4+T細胞在結直腸癌患者腫瘤組織微環境中比例的研究結果相似，其具體機制可能與LAP+CD4+T細胞能分泌高濃度細胞免疫抑制因子TGF-β及IL-17有關，但其具體機制有待進一步研究。

綜上所述，免疫磁珠法分選細胞設備簡便，價格低廉，操作過程簡單快速，在短時間內可獲得高純度及高存活率細胞，且無需特殊處理即可進行細胞培養、流式細胞儀分析檢測等相關實驗研究。因此，免疫磁珠分選技術是分選LAP+CD4+T細胞的有效方法，有良好應用前景。

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Isolation, purification and functional identification of LAP+CD4+regulatory T cells from human peripheral blood of patients with colorectal carcinoma

YANGZuqing,JIANGZhiyuan,ZHONGWu,WANGShijun,CAOYunfei

(FirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To explore a method for isolating and purifying LAP+CD4+regulatory T (LAP+CD4+T) cells from human peripheral blood of patients with colorectal carcinoma (CRC) by magnetic activated cell sorting (MACS) and to investigate the function of these T cells in vitro. Methods LAP+CD4+T cells were isolated by MACS two-step method (negative sorting and positive sorting). The purity and the survival of these T cells were identified by flow cytometry (FACS) and Typan blue staining. The inhibition effect of LAP+CD4+T cells on the proliferation of LAP-CD4+T cells was determined by CCK-8. The expression of IL-10 and TGF-β was measured by ELISA.Results The purity of LAP+CD4+T cells isolated by MACS was 95.16%±2.11%. The cell viability was 93.64%±1.33%. The proliferation of LAP-CD4+T was obviously inhibited by intervention of LAP+CD4+T cells. The suppressor cytokine, TGF-β and IL-10, which were secreted by LAP+CD4+T cells was more than that of LAP-CD4+T cells.Conclusion MACS used for isolating LAP+CD4+T cells from peripheral blood of patients withe CRC has advantages of high efficiency, high speed, and high purity and no damage to cell activity.

colorectal carcinoma; magnetic activated cell sorting; LAP+CD4+regulatory T cells

國家自然科學基金資助項目(81250316)。

陽祖慶(1989-)，男，碩士在讀，主要研究方向為結直腸癌發病機制的基礎研究。E-mail：290572913@qq.com

簡介：曹云飛(1971-)，男，博士，副主任醫師，主要研究方向為結直腸癌發病機制的基礎研究。E-mail：caoyunfei126@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.41.007

R735.3

A

1002-266X(2016)41-0026-04

2016-07-10)