EBLN2基因對肝癌細胞增殖的抑制作用及其機制

魏巖冰，韓澤廣,2,3

(1上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院，上海200025；2國家人類基因組南方研究中心；3上海交通大學系統生物醫學院)

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EBLN2基因對肝癌細胞增殖的抑制作用及其機制

魏巖冰1，韓澤廣1,2,3

(1上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院，上海200025；2國家人類基因組南方研究中心；3上海交通大學系統生物醫學院)

目的 探討人類內源性非逆轉錄博納病毒樣核蛋白序列2(EBLN2)基因對肝癌細胞增殖的抑制作用及其機制。方法 采用實時定量RT-PCR技術和蛋白印跡技術檢測EBLN2基因在肝癌細胞系(HepG2、SK-hep-1、Huh7、Hep3B、MHCC-97H、PLC/PRF/5、Focus、SMMC7721、YY-8103、LO2)和人肝癌組織樣本中的表達；選取EBLN2表達水平較低的肝癌細胞株Focus和YY-8103進行外轉質粒過表達，Pcmv-EBLN2重組質粒轉入肝癌細胞株Focus和YY-8103，24 h觀察EBLN2基因過表達對肝癌細胞株細胞增殖、平板克隆形成能力及軟瓊脂克隆形成能力、細胞周期的影響。結果 定量和半定量PCR實驗結果表明EBLN2基因在59%的肝癌樣本中表達下調，且在10株肝癌細胞系(HepG2、SK-hep-1、Huh7、Hep3B、MHCC-97H、PLC/PRF/5、Focus、SMMC7721、YY-8103、LO2)中表達水平與正常肝組織相比明顯下調，依次下調48%、73%、72%、79%、84%、72%、87%、74%、82%、80%，P均<0.05；Pcmv-EBLN2質粒轉染肝癌細胞株YY-8103和Focus 24 h后，肝癌細胞株YY-8103和Focus的細胞增殖率分別為72.2%、85.0%，平板克隆形成率分別為52.6%、25.6%，軟瓊脂克隆形成率分別為40.9%、37.5%，與空白對照相比，P均<0.05；肝癌細胞株YY-8103和Focus從G1期進入S期受到抑制。結論 EBLN2基因在肝癌組織中表達下調，其可能通過調節細胞周期抑制肝癌細胞增殖。

肝細胞癌；人類內源性非逆轉錄博納病毒樣核蛋白序列2基因；抑癌基因；細胞增殖

肝細胞癌(HCC)是肝癌最常見亞型，占肝癌確診和致死人數的70%～80%。盡管近年來肝癌治療手段不斷發展，但5年致死率仍約7%[1～5]。因此，研究肝癌發生的分子機制，尤其針對最新發現的癌基因和抑癌基因在癌癥發生發展中的作用對肝癌診斷、治療有重要意義[6, 7]。人類內源性非逆轉錄博納病毒樣核蛋白序列(EBLNs)基因是最近研究發現的遠古時期博納病毒核蛋白基因整合到人類染色體上并穩定存在的基因家族[8～10]。EBLN2是該家族中的重要成員，在人類和其他哺乳動物中廣泛存在。有研究報道EBLN2基因在宿主細胞內可能已進化為有益成分，對宿主細胞起到一定保護作用[11]。然而，該基因在肝癌發生、發展中作用的研究鮮見報道。2014年12月～2015年12月，我們探討了EBLN2基因對肝癌細胞增殖的抑制作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 本實驗所用肝癌組織均取自上海市第十人民醫院病理科肝癌患者手術切除組織塊，患者手術前簽署知情同意書，并得到國家人類基因組南方研究中心道德理論委員會的批準，離體組織塊-80 ℃保存。本實驗中所用10株肝癌細胞株HepG2、SK-hep-1、Huh7、Hep3B、MHCC-97H、PLC/PRF/5、Focus、SMMC7721、YY-8103、LO2均為本中心液氮罐里實驗室保存。所用試劑有TRIzol試劑，氯仿，Annexin-V FITC 和PI 雙染試劑盒，反轉錄試劑盒，TaKaRa公司預混Taq Premix polymerase 試劑盒，SYBR Premix ExTaq試劑盒，蛋白質裂解液，瓊脂糖，SDS，蛋白質甲巰基乙醇上樣緩沖液，Lipofectamine2000，DMEM培養液，胰酶，70%乙醇，磷酸鹽緩沖液，20%胎牛血清，碘化丙啶，考馬斯亮藍，RNase。儀器：六孔板，培養皿，EP管，滅菌鍋，培養箱，離心機，PCR儀，流式細胞分選儀，移液槍，超凈工作臺，電泳儀，酶標儀，顯微鏡。

1.2 組織和細胞RNA提取 采用TRIzol法。稱取適量肝癌組織塊，在液氮條件下研磨粉末狀，取粉末于EP管中，加入TRIzol試劑裂解約15 min，貼壁細胞RNA提取時直接棄去配液并用PBS洗滌，加TRIzol裂解約15 min。然后采用酚-氯仿法抽提RNA，并用酶標儀測定RNA濃度，注意RNA提取過程中無菌操作，所用EP管等為無RNase污染。使用TAKARA公司反轉錄試劑盒中的SYBR Green Assay試劑，根據試劑盒使用說明書，將2 μg RNA逆轉錄成cDNA分子，-20 ℃備用。

1.3 EBLN2基因表達檢測 采用RT-PCR和半定量RT-PCR法。目的基因EBLN2的RT-PCR引物：上游引物5′-GAACGAGGAAAGGGGTACTCC-3′；下游引物5′-CCAGCCGCAATGCCTATCAA-3′。內參基因β-actin的RT-PCR引物：上游引物5′-AGCGAG-CATCCCCCAAAGTT-3′；下游引物5′-GGGCACGAA-GGCTCATCATCATT-3′。半定量PCR以cDNA為模板，用TaKaRa公司預混Taq Premix polymerase 試劑，擴增目的片段和內參基因，反應體系：模板1 μL，預混聚合酶7.5 μL，上下游引物各1 μL；雙純水補至15 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；56 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s；其中EBLN2擴增30個循環，內參基因擴增25個循環。PCR擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。實時熒光定量PCR實驗用TP800實時定量PCR儀和SYBR Premix ExTaq試劑盒進行。反應體系：預混的熒光Taq復合物12.5 μL；上、下游引物各1 μL；模板2 μL；雙純水補至25 μL。反應條件：95 ℃變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。

1.4 EBLN2蛋白表達檢測 采用蛋白印跡實驗檢測 EBLN2表達。細胞和組織樣品用蛋白裂解緩沖液提取蛋白質甲巰基乙醇上樣緩沖液后95 ℃使蛋白質變性，然后進行SDS凝膠電泳，檢測目的基因蛋白表達。β-actin作內參。

1.5 Pcmv-EBLN2轉染肝癌細胞Focus和YY-8103 選取EBLN2表達水平較低的細胞株(Focus和YY-8103)進行外轉質粒過表達，Pcmv-EBLN2重組質粒轉入肝癌細胞株Focus和YY-8103，細胞轉染實驗使用Lipofectamine2000轉染試劑。Pcmv-EBLN2質粒引物：EBLN2上游引物(Sal I)5′-ACGCGTCGACTATGGGTTATTTTCTTAAATTGTATG-CT-3′；下游引物(Not I)5′-ATAAGAATGCGGCCGCCTAACTTGCGTAGCTTGTGTA-3′。轉染前1 d接種適量細胞，使轉染時細胞數量達70%左右。以3.5 cm培養皿為例，轉染時取5 μL脂質體與250 μL無血清的基本培養基混合，2 μg質粒與250 μL無血清基本培養基混合，室溫靜置5 min；將上述兩種混合液混合并室溫靜置30 min，加入至無抗生素無血清的培養基細胞中；培養箱培養，約4 h后更換成完全培養基，獲得EBLN2過表達肝癌細胞株Focus和YY-8103。

1.6 EBLN2過表達肝癌細胞株細胞增殖的檢測 肝癌細胞株Focus和YY-8103轉染48 h后接種至96孔板中，每孔接種約3×103個細胞，待細胞貼壁后以24 h為1個檢測單位，每孔待測細胞中加入CCK-8 10 μL，培養箱培育1 h，用酶標儀于450 nm波長處檢測吸光度值，繪制生長曲線，計算細胞增殖率。

1.7 EBLN2過表達肝癌細胞株細胞克隆形成率的測算 肝癌細胞株Focus和YY-8103轉染48 h后接種到六孔板，每孔約3 000個細胞，用含終濃度為4～8 μg/mL G418的DMEM培養箱培養，每周更換一次培養液，觀察2～3周時用考馬斯亮藍染色并拍照，觀察整體細胞克隆數目。

1.8 EBLN2過表達肝癌細胞株軟瓊脂克隆形成率的測算 分別配制1%和2%的低熔點瓊脂糖，高溫滅菌處理；配制2×DMEM，含20%胎牛血清的2×DMEM和2%的低熔點瓊脂糖等體積混合，加入24孔板，每孔500 μL，冰箱放置約10 min至凝固；用胰酶消化細胞，每孔接種約3 000個細胞，細胞懸液與1%的瓊脂糖等體積混合；每孔加入500 μL于下層膠上；冰箱放置約10 min；凝固后每孔加入約100 μL普通新鮮配液，培養箱培養約3周，顯微鏡下觀察每個孔的克隆數目并拍照進行統計學分析。

1.9 EBLN2過表達肝癌細胞株細胞周期的檢測 采用流式細胞分析儀檢測。Pcmv-EBLN2重組質粒轉入肝癌細胞株Focus和YY-8103 48 h后用胰酶消化成單細胞，收集到15 mL離心管中離心，用磷酸鹽緩沖液洗滌單細胞2～3次；70%乙醇固定細胞；碘化丙啶避光染色10 min，同時加入RNase；上樣檢測，每個樣品收集10萬個細胞，進行流式分選。

1.10 統計學方法 采用Graphpad prissm5軟件進行數據分析并作圖。計量數據以表示，各樣本間的差異計算采用t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同肝癌細胞株中EBLN2表達比較 定量和半定量PCR實驗結果顯示EBLN2基因在59%的肝癌組織樣本中表達下調，EBLN2基因在HCC細胞株中表達水平較低，10株肝癌細胞系(HepG2、SK-hep-1、Huh7、Hep3B、MHCC-97H、PLC/PRF/5、Focus、SMMC7721、YY-8103、LO2、)中EBLN2蛋白相對表達量依次為0.048±0.000 5、0.073±0.000 5、0.072±0.000 5、0.079±0.000 5、0.084±0.000 5、0.072±0.000 5、0.087±0.000 5、0.074±0.000 5、0.082±0.000 5、0.080±0.000 5。

2.2EBLN2 過表達對肝癌細胞增殖、克隆形成和軟瓊脂克隆形成的影響 與空白對照相比，肝癌細胞株Focus和YY-8103細胞增殖率分別為72.2%、85%，平板克隆形成率分別為52.6%、25.6%；軟瓊脂克隆形成率分別為40.9%、37.5%，P均<0.05。

2.3EBLN2過表達對肝癌細胞周期的影響 與空白對照相比，肝癌細胞株Focus和YY-8103細胞停滯于G1期。

3 討論

目前對于哺乳動物基因插入病毒基因序列的研究已較清晰，即插入片段對病毒具有選擇性保護作用。然而，內源性逆轉錄或非逆轉錄病毒基因序列插入哺乳動物基因組后在宿主細胞內發揮的作用及其作用機制仍不清晰。

EBLN基因是最新研究發現并命名的一類基因家族，最初由博納病毒基因整合至多種哺乳動物基因組DNA序列，并在宿主細胞內傳遞和進化[12,13]。EBLN家族中的部分成員包括完整的開放閱讀框，能表達mRNA。在類基因組中包括EBLN1、EBLN2、EBLN3和EBLN4四個成員，其中EBLN1與EBLN2同源性較高，且均能在宿主細胞內翻譯出蛋白質分子。最近有報道EBLN2可與細胞內蛋白質AP1S1、TUSC2/FUS1及FANCC相互作用[14]，此暗示EBLN家族成員可能表達功能性蛋白質。而關于EBLN2基因在肺癌樣本中表達明顯下調甚至消失的報道說明EBLN2可能在宿主細胞內作為抑癌基因起作用；同時，有研究發現EBLN2基因在乳腺癌和宮頸癌中表達亦明顯下調[15]。然而對該基因在肝癌中的探究鮮見報道。

本研究發現，EBLN2在肝癌樣本中與癌旁組織相比表達明顯下調；同時，EBLN2在肝癌細胞系中表達水平較低，提示EBLN2可能在肝癌發生中有一定作用。此外，過表達EBLN2能顯著抑制肝癌細胞Focus和YY-8103的生長、克隆形成和軟瓊脂克隆形成。EBLN2基因過表達后Focus和YY-8103細胞的增殖過程被阻滯于G0～G1期。肝癌細胞的無限增殖和非錨定增殖是惡性腫瘤的重要特性，我們的實驗數據表明EBLN2基因能明顯抑制肝癌細胞的增殖和非錨定生長過程，EBLN2基因可能在肝癌細胞系中發揮抑癌基因功能。

綜上所述，EBLN2基因在人肝細胞內可能已共同化為對宿主細胞有益的抑癌基因，并通過調節細胞周期發揮抑制肝癌細胞株增殖的作用，此為內源性病毒元件與宿主細胞的共同進化提供了科學依據。

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Inhibitory effect of EBLN2 gene on proliferation of hepatocellular carcinoma cells

WEIYanbing1,HANZeguang

(1RuijinHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200025,China)

Objective To study the inhibitory effects of endogenous Bornavirus-like nucleoprotein 2 (EBLN2) gene on proliferation of hepatocellular carcinoma (HCC) cell lines and its mechimasm. Methods The real-time fluorescent quantitative RT-PCR and Western blotting was used to detect the expression of EBLN2 in HCC cell lines (HepG2, SK-hep-1, Huh7, Hep3B, MHCC-97H, PLC/PRF/5, Focus, SMMC7721, YY-8103 and LO2) and human HCC tissue samples. The overexpression of EBLN2 was carried out in Focus and YY-8103 cells with low expression of EBLN2. The recombinant plasmid pCMV-EBLN2 was transfected into Focus and YY-8103 cells.At 24 h, the effects of overexpression of EBLN2 gene on the proliferation of HCC cell lines, plate clone formation ability, soft agar clone formation ability, and cell cycle.Results The quantitative and semi-quantitative PCR results showed that EBLN2 mRNA expression was down-regulated in 59% HCC samples. Further, compared with the normal hepatic tissues, EBLN2 expression was down-regulated in cell lines such as HepG2, SK-hep-1, Huh7, Hep3B, MHCC-97H, PLC/PRF/5, Focus, SMMC7721, YY-8103 and LO2 with the percentage of 48%, 73%, 72%, 79%, 84%, 72%, 87%, 74%, 82% and 80%, respectively (allP<0.05). After the Pcmv-EBLN2 plasmid was transferred into cell lines YY- 8103 and Focus for 24 h, the proliferation rates of YY-8103 and Focus cell lines were 72.2% and 85%. The plate clone formation rates of YY-8103 and Focus cells were 52.6% and 25.6%, and the soft agar clone formation rates of YY-8103 and Focus cells were 40.9% and 37.5%, and significant difference was found, allP<0.05. The cell cycle transition from G1phase to S phase was inhibited in the YY-8103 and Focus cells.Conclusions EBLN2 is down-regulated in HCC tissues and inhibits the proliferation of HCC cells by regulating the cell cycle.

hepatocellular carcinoma; endogenous Bornavirus-like nucleoprotein 2; tumor suppressor gene; cell proliferation

國家科技重大專項課題(2012zx10001012)。

魏巖冰(1988-)，女，碩士研究生，主要研究方向為腫瘤(肝癌)分子遺傳學。E-mail：wyb2013@sjtu.edu.cn

簡介：韓澤廣(1964-)，男，博士，教授，主要研究方向為腫瘤(肝癌)分子遺傳學、基因組學和系統生物學應用。E-mail：hanzg@sjtu.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.41.002

R735.7

A

1002-266X(2016)41-0006-04

2016-06-20)