蛋白質組學在腰椎間盤突出癥中的研究進展

楊敏，徐桂華

(南京中醫藥大學護理學院，南京210000)

·綜述·

蛋白質組學在腰椎間盤突出癥中的研究進展

楊敏，徐桂華

(南京中醫藥大學護理學院，南京210000)

腰椎間盤突出癥(LDH)是骨科常見病與多發病，其機制的初步探明已為LDH的診斷與治療提供了重要信息，但更深層次的分子機制尚不明了。蛋白質組學注重參與特定生理或病理狀態下的所有蛋白質，為篩選疾病特異性生物標記物，探索發病機制與治療靶點提供了新途徑。蛋白質組學的常用技術包括蛋白質分離技術、蛋白質鑒定技術、生物信息學技術以及相對和絕對定量同位素標記技術等，其在研究LDH中醫證型診斷，神經根損傷、坐骨神經痛以及腰椎退行性變發病機制中的應用已經比較明確，且取得了一定進展。

腰椎間盤突出癥；蛋白質組學；蛋白質分離技術；神經根損傷；腰椎退行性變

腰椎間盤突出癥(LDH)是指腰椎間盤各部分發生退行性變后，在外力因素的作用下，纖維環部分或全部破裂，單獨或連同髓核、軟骨終板向外突出，導致竇椎神經和神經根遭受刺激或壓迫，從而引起以腰腿痛為主要癥狀的一種疾病。LDH為骨科常見病和多發病，占門診腰痛患者的10%～15%，占骨科腰腿痛住院患者的25%～40%[1]。近年來LDH的發病率呈升高趨勢[2]。蛋白質組學技術的研究對象是生命活動的最終執行者——蛋白質，該技術可篩選出與疾病相關的特異性生物標記物，有助于探索發病機制與治療靶點，為LDH的深入研究提供新思路。

1 蛋白質組學的常用技術

蛋白質組的概念由澳大利亞學者Wilkins和Williams于1994年提出，是指一個細胞或一個組織基因組所表達的全部蛋白質[3]。由其引申出的蛋白質組學則是從整體角度出發，分析細胞內動態變化的蛋白質組成成分、表達水平和修飾狀態，了解蛋白質之間相互作用和聯系，使人們能夠在分子水平上定量、動態、整體探討生命活動的規律和生命現象的本質[4]。目前，蛋白質組學的常用技術包括蛋白質分離技術、蛋白質鑒定技術、生物信息學技術及相對和絕對定量同位素標記技術。

1.1 蛋白質分離技術 該技術主要包括雙向凝膠電泳(2-DE)、雙向熒光差異電泳以及液相色譜(LC)技術等，其中2-DE為最經典、最成熟的蛋白質組學分離技術，它依據蛋白質等電點與相對分子質量的不同而實現蛋白高通量的分離。2-DE技術在第一向IPG 膠條的制備和第二向凝膠的處理方面都有了很大提高，已廣泛應用于醫學研究。Qian等[5]運用該技術發現了與膽固醇結石形成有關的4種蛋白質；Ayyub等[6]憑借該技術發現了可能對肺癌早期診斷有價值的蛋白生物標記物。

1.2 蛋白質鑒定技術 目前最普遍的蛋白質鑒定技術為生物質譜分析技術，質譜可先將分析物離子化，隨后質荷比不同的帶電粒子在空間或時間上分離并排列成圖譜，根據所形成的圖譜對分析物進行檢測鑒定[7]。常用的一級質譜技術有基質輔助激光解析飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)、電噴射離子井飛行時間質譜以及表面增強激光解析電離飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)等。除此以外，二級質譜即同時將兩個一級質譜連在一起構成的串聯質譜(MS/MS)，因具有較高的特異性與靈敏性，且所需樣本量少，逐漸受到研究者的青睞。如串聯質譜技術作為新生兒遺傳代謝疾病的初篩手段，大大提高了疾病檢出率，有助于疾病的早期診斷和治療，從而降低病死率，改善預后[8]。

1.3 生物信息學技術 經過分離與鑒定，還需對蛋白質的功能和結構進行分析。蛋白質的功能分析一般采用Mascot搜索Swiss-prot、PIR等常用的蛋白質序列數據庫，將樣品蛋白質與已知蛋白質序列進行比較以了解其功能；也可通過蛋白質的物理性質進行預測，或者與保守基序和圖形數據庫比較，以判斷其功能。相比蛋白質功能的測定，蛋白質結構的測定則困難許多。雖然在PDB等數據庫中可檢測到蛋白質高級結構的同源性，但蛋白質的折疊過程仍不清晰。蛋白質三維結構的預測是目前最困難、最復雜的預測技術，目前采用的方法有同源模建、threadin算法等[9]。

1.4 相對和絕對定量同位素標記(iTRAQ)技術 iTRAQ技術是美國應用生物系統公司在2004年推出的一項新的體外同位素標記技術，具有高通量、高靈敏的特點，它的出現促使比較蛋白質組學向定量蛋白質組學升級發展[10]。iTRAQ技術的流程如下：將樣品酶分解為肽段后，分別用iTRAQ試劑進行差異標記、混合，最后用液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)技術進行分析。該技術可對同一實驗下的8個樣品同時進行相對量化，大大降低實驗過程中的技術誤差，因此很多醫學研究者用此技術尋找疾病狀態下的特異表達蛋白，以發現治療藥物的新靶點。Ran等[11]通過對15例胃癌患者的胃組織進行iTRAQ技術分析，發現包括嗅質蛋白4在內的4種蛋白質表達上調，且體外研究發現抑制嗅質蛋白4的表達后，胃癌細胞的轉移、侵襲與增殖也受到抑制。因此，抑制嗅質蛋白4的表達可能成為未來抗癌藥物研制的方向之一。

2 蛋白質組學在LDH中的應用

2.1 在LDH中醫證型診斷中的應用 蛋白質組學是研究生物信息學在整體水平上的相互作用，與中醫的整體觀念不謀而合，并且其客觀的研究結果可彌補傳統中醫辨證指標主觀性強的缺點[12]。蛋白質組學運用于LDH的中醫證型診斷為研究其辨證規律提供了新思路。許建文等[13]應用SELDI-TOF-MS技術對LDH血瘀證患者、LDH非血瘀證患者和健康人血清蛋白質組學進行了比較研究，發現了11個差異蛋白質點；其采用Biomarker Patterns軟件構建LDH血瘀證的血清學診斷模型，結果顯示LDH血瘀證患者ROC曲線下面積為0.984，說明該血清學診斷模型的診斷價值較高。趙偉等[14]采用SELDI-TOF-MS技術及蛋白質芯片技術檢測壯族LDH血瘀證患者、漢族LDH血瘀證患者、壯族LDH非血瘀證患者和漢族LDH非血瘀證患者的血清樣本，共找出13個表達顯著差異的蛋白質點，并由此構建出壯族LDH血瘀證的血清學診斷模型；經盲法驗證，該模型陽性預測值達到94.44%，表明由13個差異表達蛋白構成的診斷模型可區分壯族與其他民族LDH血瘀證及其他中醫證型。以上研究為應用生物標志物進行LDH的中醫辨證奠定基礎。

2.2 在神經根損傷發病機制研究中的應用 神經根受壓是LDH的主要病理特征之一，除了單純的機械作用，突出的髓核可能引起神經根的生化與免疫反應，從而引起LDH的一系列臨床癥狀。Liu等[15]采集觀察組(LDH引起的脊神經根損傷患者)與對照組(椎間盤正?；颊?的腦脊液，使用2-DE結合LC-IT-MS技術分析腦脊液蛋白質，結果發現兩組間存在15個表達差異的蛋白質點，其中9個在觀察組腦脊液中水平升高，包括胱抑蛋白C、載脂蛋白A-IV、維生素D結合蛋白、神經微絲的3種L蛋白、四連接素、免疫球蛋白G和血紅蛋白，并通過ELISA法證實了這些蛋白質表達的改變可能與LDH引起的脊神經根損傷有關。有研究建立了大鼠背根神經節持續受壓(CCD)模型，28天后處死大鼠，提取蛋白，先通過雙向電泳分離蛋白，找出差異表達蛋白質點后運用MALDI-TOF-MS技術進行鑒定，分析所得肽指紋圖譜，發現共15種差異表達的蛋白；其中7種蛋白在CCD組表達上調(其中1種蛋白只存在于CCD組)，并推測膜聯蛋白A2、p11和蛋白激酶Ce蛋白表達的上調可能參與了神經性疼痛的發生[16, 17]。

2.3 在坐骨神經痛發病機制研究中的應用 LDH是導致坐骨神經痛的主要原因之一，但其機制尚未明確；椎間盤源性痛目前主要依賴經驗推測，無法通過臨床診斷證實[18]，而蛋白質組學有可能成為該病最有效的生物標記物追蹤技術。Xie等[19]借助2-DE結合MALDI-TOF-MS技術，分析了30例由LDH引起坐骨神經痛患者與30位健康志愿者的血清樣本，發現了6種差異蛋白質，包括表達升高的載脂蛋白-L1與兩種血清白蛋白前體，以及表達降低的載脂蛋白M、四連接素與免疫球蛋白輕鏈；并通過ELISA法進行反向驗證，結果表明載脂蛋白-L1、載脂蛋白M、四連接素以及免疫球蛋白輕鏈這4種蛋白質可能是與LDH引起的坐骨神經痛相關的生物標志物。

2.4 在腰椎退行性變研究中的應用 腰椎退行性變是LDH發生的致病基礎，因此腰椎退行性變后的蛋白質組學研究也成為LDH蛋白質組學研究的重要方向[20]。馮皓宇等[21]采用2-DE聯合MALDI-TOF-MS對人正常椎間盤纖維環和髓核細胞外基質分子蛋白進行鑒定，發現了19種相同的蛋白質，為進一步研究這些蛋白質在椎間盤退變過程中的變化打下基礎。呂志德等[22]通過2-DE和MALDI-TOF-MS技術確定了正常和退變腰椎間盤組織中的6種差異蛋白質，有助于深入研究這些蛋白質在腰椎退行性變過程中的作用及其機制。Ye等[23]通過對椎間盤退行性變患者與正?；颊叩睦w維環細胞蛋白質表達進行分析，找到了10種差異表達的蛋白質，認為這些蛋白質與椎間盤退行性變的發病有關，并可作為其生物標志物。Yee等[24]采用iTRAQ標記LC-MS/MS技術，發現退變椎間盤組織中Ⅰ型膠原蛋白、纖連蛋白與HTRA1等蛋白表達上調，這種變化在年輕椎間盤退化患者的纖維環組織中亦能觀察到，證實椎間盤細胞外基質的改變與其衰老和退化有關。以上研究可為腰椎退行性變生物特異性標記物的確定及靶向藥物的研發提供參考。

綜上所述，與傳統技術注重研究單一蛋白質不同，蛋白質組學注重研究參與特定生理或病理狀態下的所有蛋白質，這樣的優勢使其在多個醫學領域被廣泛研究與應用。LDH的早期防治與發病機制的闡明是目前醫學的難點和重點，但蛋白質組學的興起為該問題的解決帶來了新的希望。盡管與骨科其他經典的檢驗技術相比，蛋白質組學技術尚不成熟，如2-DE技術檢測敏感性與分辨率較低，質譜技術對低分子量蛋白質的鑒定效果欠佳等。但是，隨著現有技術的不斷完善和更多新技術的產生，蛋白質組學技術會為闡明LDH的發病機制、識別早期病變、明確診斷等做出更大的貢獻。目前，運用蛋白質組學闡明LDH發病機制的研究正在開展，但是尚缺乏運用該技術探討蛋白質變化與治療效果之間關系的研究，今后可從蛋白質組層面闡述LDH的治療手段。

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國家自然科學基金資助項目(81473791)；江蘇省基礎研究計劃自然科學基金資助項目(BK20141464)；江蘇省第四期“333工程”培養基金資助項目。

徐桂華(E-mail: xgh88@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.16.037

R681.5

A

1002-266X(2016)16-0095-03

2015-11-26)