含笑內酯對三陰性乳腺癌細胞順鉑化療敏感性的影響及機制探討

孟文靜，謝曉娟，周立艷，賈勇圣，佟仲生

(天津醫科大學腫瘤醫院 國家腫瘤臨床醫學研究中心,天津300060)

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含笑內酯對三陰性乳腺癌細胞順鉑化療敏感性的影響及機制探討

孟文靜，謝曉娟，周立艷，賈勇圣，佟仲生

(天津醫科大學腫瘤醫院 國家腫瘤臨床醫學研究中心,天津300060)

目的 觀察含笑內酯(MCL)對三陰性乳腺癌(TNBC)細胞順鉑(DDP)化療敏感性的影響，并分析其可能的機制。方法 將TNBC細胞分為MCL組、DDP組、DDP+MCL組，分別加入MCL、DDP和DDP+MCL；另設空白對照組，加入等體積培養基。培養24 h后，采用CCK8法測算細胞存活率，計算聯合指數(CI)評價兩藥是協同(CI<0.9)或相加(CI 0.9～1.1)關系；采用流式細胞儀檢測凋亡細胞，計算細胞凋亡率；采用酶標儀檢測細胞上清液中的谷胱甘肽。結果 MCL(2.5～10 μmol/L)、DDP(1.25～5 μmol/L)聯合作用TNBC細胞時，CI<0.85；空白對照組、MCL組、DDP組、MCL+DDP組細胞凋亡率分別為4.3%±1.3%、7.6%±2.0%、13.4%±4.3%、37.0%±5.7%，MCL+DDP組細胞凋亡率明顯高于其他3組(P均<0.01)。空白對照組、MCL組、DDP組、MCL+DDP組細胞上清液中谷胱甘肽水平分別為(43.54±3.71)、(35.85±2.67)、(50.33+3.16)、(38.46±1.74)mmol/mg，MCL組、MCL+DDP組﹤空白對照組﹤DDP組，P均<0.05；MCL組、MCL+DDP組比較，P>0.05。結論 MCL可通過降低細胞內谷胱甘肽水平，從而增強TNBC細胞對DDP的敏感性。

三陰性乳腺癌；含笑內酯；順鉑；耐藥

乳腺癌是一種高度異質性疾病，不同分子分型乳腺癌的治療和預后差異較大。三陰性乳腺癌(TNBC)是指一類雌激素受體、孕激素受體及人表皮生長因子受體2(HER-2)表達均陰性的乳腺癌，其侵襲性強，預后較差，缺乏分子靶點，內分泌治療及抗HER-2靶向治療均無效。目前，順鉑(DDP)是治療TNBC的主要化療藥物，但可導致腫瘤細胞內谷胱甘肽水平升高從而降低藥物敏感性，增加耐藥的概率。因此，如何提高TNBC對DDP的敏感性成為研究熱點之一。含笑內酯(MCL)是從70多種藥物中篩選出的一種小分子化合物，其主要成分為倍半萜內酯，可以用小白菊內酯(PTL)為原料，在一定溶劑和溫度下反應得到。因MCL衍生于PTL，故其活性與PTL相當，但穩定性更高，血漿半衰期為PTL的6倍，并且成本較低[1，2]。2015年1～3月，我們觀察了DDP聯合MCL對TNBC細胞增殖、凋亡及谷胱甘肽水平的影響，探討MCL增強TNBC細胞對DDP敏感性的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人三陰乳腺癌細胞株MDA-MB-231，來源于天津醫科大學腫瘤醫院乳腺癌重點實驗室；DDP購自美國Sigma公司；MCL由天津尚德藥緣科技股份有限公司合成，分子式為C15H20O3，配置時用二甲基亞砜(DMSO)溶解；CCK-8檢測試劑盒購自日本同仁化學研究所，細胞凋亡檢測試劑盒購自BD生物科技公司，谷胱甘肽檢測試劑盒、RIPA裂解液及ECL發光液購自北京碧云天生物技術公司。

1.2 細胞培養 MDA-MB-231細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養液，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養；每3～4日傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 MCL對DDP化療作用的影響觀察 取對數生長期細胞，按1×104/孔接種96孔板，37 ℃過夜。將細胞隨機分為3組，MCL組給予0、2.5、5、10、20、40 μmol/L 的MCL，DDP組給予0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L的DDP，MCL+DDP組別以MCL、DDP各自相應的倍比濃度；每個濃度設3復孔，37 ℃培養24 h。棄上清，更換含10%體積分數CCK-8的完全培養基，37 ℃繼續培養4 h。采用自動酶標儀(Bio-Rad)檢測各孔490 nm波長的光密度(OD)值，計算MCL、DDP對MDA-MB-231細胞增殖的IC50值。依據中效原理(Chou-Talalay聯合指數法)為基礎，應用Combidrug統計軟件計算聯合指數(CI)，并評價兩藥是協同(CI<0.9)或相加(CI 0.9～1.1)關系。

1.4 細胞凋亡觀察 取對數生長期細胞，按1×105/孔接種于6孔板，37 ℃過夜。將細胞分為空白對照組(加入等體積培養基)、MCL組、DDP組、DDP+MCL組，每組設3個復孔，分別加入MCL 5 μmol/L、DDP 5 μmol/L、DDP 5 μmol/L+MCL 5 μmol/L。37 ℃培養24 h后，胰酶消化；收集細胞，離心，PBS沖洗；分別加入緩沖液50 μL、AnnexinⅤ-FITC 5 μL、PI染液10 μL，上流式細胞儀檢測凋亡細胞。實驗重復3次，計算細胞凋亡率。

1.5 細胞上清液谷胱甘肽檢測 取對數生長期細胞，以1×105/孔接種于6孔板，細胞分組及藥物處理同1.4。37 ℃培養24 h后，PBS洗滌，胰酶消化；離心收集細胞，棄上清；加入細胞沉淀體積3倍量的蛋白去除試劑S溶液，充分震蕩后用液氮和37 ℃水浴對樣品進行兩次快速凍融。冰浴放置5 min后，離心取上清液。用蛋白去除試劑稀釋5倍后，將標準品和樣品各10 μL分別加入96 孔板中；加入總谷胱甘肽檢測工作液150 μL，25 ℃孵育5 min；加入0.16 mg/mL NADPH 50 μL，水平振蕩混勻25 min后用酶標儀測定A412值，然后對照標準曲線計算谷胱甘肽水平。實驗重復3次。

2 結果

2.1 MCL對DDP化療作用的影響 MCL組的IC50為(38.15±2.45)μmol/L，DDP組的IC50為(20.36±2.64)μmol/L，MCL+DDP組MCL的IC50為(29.12±1.85)μmol/L、DDP的IC50為(8.12±2.71)μmol/L，MCL+DDP組DDP的IC50較DDP組明顯降低(P<0.05)。較低濃度DDP(1.25～5 μmol/L)、MCL(2.5～10 μmol/L)聯合作用細胞時呈協同作用(CI<0.85)，隨著藥物濃度的增加兩藥聯合趨于相加(CI>1.05)。

2.2 各組細胞凋亡率比較 空白對照組、MCL組、DDP組、MCL+DDP組細胞凋亡率分別為4.3%±1.3%、7.6%±2.0%、13.4%±4.3%、37.0%±5.7%，MCL+DDP組細胞凋亡率明顯高于其他三組(P均<0.01)。

2.3 各組細胞上清液谷胱甘肽水平比較 空白對照組、MCL組、DDP組、MCL+DDP組細胞上清液中谷胱甘肽水平分別為(43.54±3.71)、(35.85±2.67)、(50.33+3.16)、(38.46±1.74)mmol/mg，MCL組、MCL+DDP組﹤空白對照組﹤DDP組，P均<0.05；MCL組、MCL+DDP組比較，P﹥0.05。

3 討論

目前，DDP是治療TNBC最常用的化療藥物之一，但乳腺癌細胞對DDP的耐藥作用是影響化療效果的主要原因之一。DDP是一種細胞毒性鉑類衍生物，腫瘤細胞對其耐藥機制主要包括細胞內DDP累積量減少、谷胱甘肽和巰基蛋白水平升高、DNA損傷修復[3～6]。因此，尋找能逆轉腫瘤細胞對DDP耐藥的方法成為目前研究的熱點。

PTL是從菊科植物中提取的倍半萜烯酯，可誘導乳腺癌、結腸癌及肝癌等腫瘤細胞凋亡，也可增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[7～9]。但PTL穩定性差、血漿半衰期短，限制了其臨床應用。MCL是PTL的衍生物，其活性與PTL相當，但在血漿中更加穩定，血漿半衰期也較長。本研究顯示，MCL和DDP單獨及聯合作用于TNBC細胞株MDA-MB-231時均能抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡。當兩種藥物聯合使用時，對細胞的抑制作用及凋亡誘導作用明顯強于兩藥單獨使用，具有良好的協同作用。

細胞內谷胱甘肽水平提高是腫瘤細胞對DDP敏感性降低的主要機制之一。本研究同樣發現，加入DDP后TNBC細胞內谷胱甘肽水平明顯升高。谷胱甘肽通過巰基與腫瘤細胞內的自由基結合，可以轉化成容易代謝的酸類物質從而加速自由基的排泄，有助于降低DDP療效，進而使腫瘤細胞對DDP耐藥。谷胱甘肽是一種由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸縮合而成的含有γ-酰胺鍵和巰基的三肽，其體內存在形式有氧化型(GSSH)和還原型(GSH)兩種。GSH能夠幫助機體保持正常的免疫系統功能，具有抗氧化作用和整合解毒的作用，在多種腫瘤細胞中GSH水平升高，與腫瘤細胞對抗癌藥物的抵抗有關，尤其是對鉑類的耐藥。谷氨酰-L-半胱氨酸連接酶(GCL)的基因表達是控制GSH合成、維持細胞內GSH含量穩定的重要途徑。GCL是由一個73 kD的催化亞基(GCLC) 和一個31 kD的調節亞基(GCLM)所組成的異二聚體，GCLC具有催化活性并且是GSH反饋抑制的位點[10]。另外，谷胱甘肽過氧化酶1(GPX1)同樣在GSH合成過程中發揮重要作用。

PTL可以通過抑制谷胱甘肽合成通路的關鍵酶GCLC及GPX1而干擾谷胱甘肽的合成，亦可通過活化NADPH氧化酶產生活性氧，耗竭細胞內的谷胱甘肽和蛋白巰基，從而使細胞死亡，達到抗腫瘤作用[11～13]。而MCL作為PTL的衍生物，是否二者在誘導腫瘤細胞凋亡方面存在共同作用機制，是否MCL亦可通過抑制谷胱甘肽發揮其化療增敏作用，是本實驗的研究重點。本研究結果顯示，MCL可以明顯降低TNBC細胞內谷胱甘肽水平，與DDP聯用時，有效增強TNBC對DDP的敏感性。推測PTL作為MCL的類似物，可以抑制腫瘤細胞內谷胱甘肽合成通路的關鍵酶GCLC及GPX1的蛋白表達，從而降低細胞內谷胱甘肽水平。

綜上所述，MCL可通過下調細胞內谷胱甘肽水平，抑制谷胱甘肽對DDP的解毒作用，從而增加TNBC細胞對DDP的敏感性。但是，MCL與DDP協同抗腫瘤的機制很復雜，可能還通過其他途徑引起腫瘤細胞凋亡，尚需進一步研究。

[1] Zhai JD, Li D, Long J, et al. Biomimetic semisynthesis of arglabin from parthenolide[J]. J Org Chem, 2012,77(16):7103-7107.

[2] Zhang Q, Lu Y, Ding Y, et al. Guaianolide sesquiterpene lactones, a source to discover agents that selectively inhibit acute myelogenous leukemia stem and progenitor cells[J]. J Med Chem, 2012,55(20):8757-8769.

[3] Masuda H, Ozols RF, Lai GM, et al. Increased DNA repair as a mechanism of acquired resistance to cis-diamminedichloroplatinum (Ⅱ) in human ovarian cancer cell lines[J]. Cancer Res, 1988,48(20):5713-5716.

[4] Johnson SW, Laub PB, Beesley JS, et al. Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines[J]. Cancer Res, 1997,57(5):850-856.

[5] Kawaguchi H, Terai Y, Tanabe A, et al. Gemcitabine as a molecular targeting agent that blocks the Akt cascade in platinum-resistant ovarian cancer[J]. J Ovarian Res, 2014,7:38.

[6] Galluzzi L, Vitale I, Michels J, et al. Systems biology of cisplatin resistance: past, present and future[J]. Cell Death Dis, 2014,5:e1257.

[7] Czyz M, Lesiak-Mieczkowska K, Koprowska K, et al. Cell context-dependent activities of parthenolide in primary and metastatic melanoma cells[J]. Br J Pharmacol, 2010,160(5):1144-1157.

[8] Li CJ, Guo SF, Shi TM. Culture supernatants of breast cancer cell line MDA-MB-231 treated with parthenolide inhibit the proliferation, migration, and lumen formation capacity of human umbilical vein endothelial cells[J]. Chin Med J (Engl), 2012,125(12):2195-2199.

[9] Wang WJ, Meng ZL, Mo YC, et al. Unloading the infarcted heart affect MMPs-TIMPs axis in a rat cardiac heterotopic transplantation model[J]. Mol Biol Rep, 2012,39(1):277-283.

[10] 張宗亮.谷胱甘肽在腫瘤中的研究進展[J/OL]. 泌尿外科雜志,2013,5(4):28-33.

[11] Sun Y, St CD, Xu Y, et al. A NADPH oxidase-dependent redox signaling pathway mediates the selective radiosensitization effect of parthenolide in prostate cancer cells[J]. Cancer Res, 2010,70(7):2880-2890.

[12] D′Anneo A, Carlisi D, Lauricella M, et al. Parthenolide induces caspase-independent and AIF-mediated cell death in human osteosarcoma and melanoma cells[J]. J Cell Physiol, 2013,228(5):952-967.

[13] Pei S, Minhajuddin M, Callahan KP, et al. Targeting aberrant glutathione metabolism to eradicate human acute myelogenous leukemia cells[J]. J Biol Chem, 2013,288(47):33542-33558.

Effect of Micheliolide on chemosensitivity of triple negative breast cancer cells to cisplatin

MENGWenjing,XIEXiaojuan,ZHOULiyan,JIAYongsheng,TONGZhongsheng

(TianjinMedicalUniversityCancerInstituteandHospital,NationalClinicalResearchCenterforCancer,Tianjin300060,China)

Objective To observe the effect of Micheliolide (MCL) on chemosensitivity of triple negative breast cancer (TNBC) cells to cisplatin (DDP) and the related mechanisms. Methods TNBC cells were randomly divided into MCL group, DDP group and DDP+MCL group, which were respectively added with MCL, DDP and DDP+MCL. Another blank control group was added with equal volume of culture medium. The cell viability was measured by CCK8, the CI was calculated, apoptotic cells were calculated by flow cytometry as well as the apoptosis rate, and glutathione (GSH) in supernatant was detected by ELISA.Results MCL(1-10 μmol/L) combined with DDP (1-5 μmol/L)showed an obvious synergistic effect(CI<0.85), the apoptosis rates were 4.3%±1.33%, 7.6%±2.02%, 13.4%±4.26% and 37.0%±5.74% in the control, MCL, DDP and MCL+DDP groups, respectively; the apoptosis rate of the MCL+DDP group was higher than that of the MCL group and DDP group (allP<0.05). The intracellular GSH levels were (43.54±3.71), (35.85±2.67), (50.33+3.16), and (38.46±1.74) mmol/mg in the control, MCL, DDP and MCL+DDP groups, respectively. The intracellular GSH level: MCL group, MCL+DDP group0.05.Conclusion MCL enhances the sensitivity of TNBC cells MDA-MB-231 to cisplatin by decreasing intracellular GSH levels.

triple negative breast carcinoma; micheliolide; cisplatin; drug resistance

教育部高等學校博士學科點專項科研基金資助項目(20131202120003)；天津市抗癌重大專項攻關計劃(12ZCDZSY16200)。

孟文靜(1982-)，女，醫師，主要研究方向為乳腺癌的綜合治療及基礎。E-mail: wenjingmx@163.com

簡介：佟仲生(1963-)，男，主任醫師，主要研究方向為乳腺癌的綜合治療及基礎。E-mail: tongzhongsheng@tjmuch.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.42.004

R737.9

A

1002-266X(2016)42-0014-03

2016-01-17-21)