褪黑素治療黃體功能不全的作用機(jī)制研究進(jìn)展

蔣小飛，周惠芳

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南京210029)

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褪黑素治療黃體功能不全的作用機(jī)制研究進(jìn)展

蔣小飛，周惠芳

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南京210029)

氧化應(yīng)激在黃體功能不全(LPD)發(fā)病過程中占有重要的作用。褪黑素具有強(qiáng)大的氧自由基清除和抗氧化能力，可用于改善LPD患者黃體功能及體外培養(yǎng)的卵母細(xì)胞質(zhì)量。

褪黑素；黃體功能不全；氧自由基；氧化應(yīng)激；輔助生殖技術(shù)

不孕癥是臨床三大難治疾病之一，其中3.5%～10%是由黃體功能不全(LPD)導(dǎo)致的[1]。隨著國內(nèi)晚婚年齡的提高以及二胎政策的放開，受孕年齡不斷增加，LPD所致的不孕率逐年提高，給臨床造成了很大的困擾。目前LPD的臨床治療主要包括促進(jìn)卵泡發(fā)育、促進(jìn)月經(jīng)中期黃體生成素(LH)峰的形成、黃體功能刺激療法和黃體功能替代療法。盡管目前治療策略已確立，但治療效果仍不滿意。研究[2～5]發(fā)現(xiàn)，氧自由基(ROS)是導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量下降及黃體期缺陷的重要因素。針對其病因治療，選擇一種恰當(dāng)?shù)腞OS清除劑顯得尤為必要。褪黑素作為一種強(qiáng)大的自由基清除劑和廣譜抗氧化劑[6]，因其體積小且有高度親脂親水的雙向特性，得到臨床的廣泛重視[7]。現(xiàn)就褪黑素治療LPD的作用機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 褪黑素治療LPD的機(jī)制

1.1 ROS在LPD發(fā)病中的作用 LPD是指卵巢排卵后形成的黃體內(nèi)分泌功能不足，以致孕激素分泌不足，使子宮內(nèi)膜由增生期向分泌期轉(zhuǎn)化不足，子宮內(nèi)膜容受性下降，不利于受精卵的著床，進(jìn)而導(dǎo)致不孕或習(xí)慣性流產(chǎn)。其主要原因是卵泡發(fā)育不良和排卵后卵巢黃體形成缺陷。眾所周知，ROS參與多種細(xì)胞的生理病理過程，不僅可以促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖和分化，同時(shí)還在細(xì)胞凋亡或壞死過程中發(fā)揮重要作用。過量ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、蛋白質(zhì)或DNA氧化損傷。因此，ROS的不良作用幾乎存在于人類所有的疾病，如癌癥、神經(jīng)退化和慢性炎性疾病等[2]。在女性生殖方面，排卵是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，此過程伴隨著類似炎癥的過程，表現(xiàn)為前列腺素合成的增加、細(xì)胞因子的產(chǎn)生、蛋白水解酶的作用，并伴隨血管通透性的增加。ROS是這些炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，主要包括超氧化物、過氧化氫和羥基，線粒體是其主要來源。適量的ROS是卵泡成熟的必須條件，如線粒體內(nèi)ROS參與氧化磷酸化過程為胚泡向減數(shù)分裂Ⅱ期的轉(zhuǎn)化提供能量，促進(jìn)卵泡發(fā)育，但過剩的ROS可能參與氧化應(yīng)激，損傷線粒體，并抑制三磷酸腺苷的合成，減少卵泡發(fā)育的供能，從而導(dǎo)致卵泡發(fā)育不良，而卵泡內(nèi)低三磷酸腺苷濃度與卵泡質(zhì)量低下的關(guān)系已得到證實(shí)[3,4]。過剩的ROS還可通過損傷黃體細(xì)胞膜脂質(zhì)，破壞DNA，誘使細(xì)胞凋亡[2]，促進(jìn)黃體的退化。其對顆粒細(xì)胞的損傷作用，會(huì)造成卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，同時(shí)通過抑制腺苷酸環(huán)化酶及線粒體內(nèi)膽固醇的運(yùn)輸降低黃體細(xì)胞合成孕激素[5]，從而造成LPD。Dai等[8]研究發(fā)現(xiàn)，攝入三聚氰胺的小鼠卵泡內(nèi)ROS增多，影響細(xì)胞骨架、凋亡、自噬誘導(dǎo)及表觀遺傳的修飾，最終導(dǎo)致卵巢顆粒細(xì)胞凋亡及卵泡閉鎖，從而降低小鼠的生育能力。Bedaiwy等[9]對138例接受卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(ICSI)的不孕患者調(diào)查發(fā)現(xiàn)，受孕患者卵泡內(nèi)的總抗氧化能力遠(yuǎn)高于受孕失敗的患者，這一證據(jù)表明卵泡內(nèi)的ROS過程對生殖的干預(yù)不可忽視。此外，許多臨床證據(jù)證實(shí)極端的體質(zhì)量和生活方式因素(如吸煙、飲酒、吸毒)可以促進(jìn)自由基的產(chǎn)生過剩，從而影響生育[10]。ROS及其清除劑之間的失衡可導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量下降及黃體期缺陷[11]，這可能是女性不孕的一個(gè)重要因素。針對其病因治療，選擇一種恰當(dāng)?shù)腞OS清除劑尤為必要，故而褪黑素得到了越來越多的關(guān)注。

1.2 褪黑素抗ROS的作用機(jī)制 褪黑素主要是由松果體分泌的一種吲哚類化合物，具有廣泛的生理學(xué)效應(yīng)，在延緩衰老、改善睡眠、抗擊腫瘤、調(diào)節(jié)免疫及調(diào)節(jié)生殖方面得到廣泛的應(yīng)用[12]。褪黑素對生殖系統(tǒng)的作用機(jī)制主要通過相關(guān)膜受體及核受體作用于生殖軸各層面。現(xiàn)代研究證實(shí)，褪黑素除了與其受體MT1和MT2結(jié)合發(fā)揮作用外，還可以直接與ROS相互作用，也可以改變酶抗氧化劑的活性間接消除自由基，其清除羥基自由基(·OH)的能力是谷胱甘肽的5倍，是甘露醇的8倍[13]。褪黑素更容易穿過細(xì)胞膜到達(dá)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如線粒體和細(xì)胞核，并呈高濃度聚集，預(yù)防和減少線粒體氧化應(yīng)激，從而減少后續(xù)的細(xì)胞凋亡[7]。褪黑素作用于線粒體，可增加線粒體內(nèi)電子傳遞效率，有效減少ROS生成，緩解DNA損傷[14]。更為重要的是，褪黑素可增強(qiáng)體內(nèi)其他抗氧化劑的作用，如增加超氧化物歧化酶(SOD)mRNA的表達(dá)，提高SOD活性，間接清除O2-。此外，褪黑素還可增強(qiáng)谷胱甘肽的活性，使H2O2分解增加，減少·OH的生成[15]。褪黑激素還可上調(diào)SOD、抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)，同時(shí)下調(diào)抗凋亡基因p53及Caspase-3的表達(dá)，從而減少細(xì)胞凋亡及ROS生成[16]。基于以上特性，褪黑素越來越廣泛應(yīng)用于多種涉及氧化應(yīng)激的疾病，如糖尿病、腸易激綜合征、化療后腦損傷等。

1.3 褪黑素治療LPD的機(jī)制 哺乳動(dòng)物體內(nèi)顆粒細(xì)胞中存在褪黑素受體[17]，這預(yù)示顆粒細(xì)胞可能是褪黑素作用于卵巢的一個(gè)作用靶點(diǎn)。褪黑素在人卵巢組織中的水平遠(yuǎn)高于血液，且排卵前大卵泡內(nèi)的褪黑素水平高于小卵泡[18]，提示褪黑素在卵母細(xì)胞成熟過程中起重要作用。Manca等[19]研究發(fā)現(xiàn)，松果體切除后繼發(fā)的褪黑素缺乏，導(dǎo)致了卵泡數(shù)量下降和黃體平面面積減少，并降低了黃體生成類固醇的能力，從側(cè)面證明了褪黑素對卵子成熟的重要作用。

卵泡局部產(chǎn)生的生長因子，如胰島素樣生長因子和轉(zhuǎn)錄生長因子β家族全程參與卵泡生長的調(diào)控[20]。其中由顆粒細(xì)胞與卵泡膜細(xì)胞產(chǎn)生的胰島素樣生長因子可以促進(jìn)卵泡的有絲分裂并起到抗凋亡的作用，轉(zhuǎn)錄生長因子可以刺激DNA的合成并促進(jìn)顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞產(chǎn)生雌激素和孕激素。研究[21]表明，褪黑素能夠刺激顆粒細(xì)胞產(chǎn)生胰島素樣生長因子，進(jìn)而誘導(dǎo)其受體激活兩條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路：一是PI3K/AKT通路，其主要參與細(xì)胞代謝；二是MEK/ERKs通路，其主要參與細(xì)胞的增殖及分化。

2 褪黑素治療LPD的應(yīng)用效果

目前無論是超促排卵方案還是促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑或拮抗劑的應(yīng)用均會(huì)導(dǎo)致LPD，已成為共識(shí)。臨床一般采用HCG、孕酮、雌激素等藥物治療進(jìn)行相應(yīng)治療，褪黑素已被嘗試應(yīng)用于輔助生殖療程中。

2.1 體內(nèi)應(yīng)用 臨床在輔助生殖過程中使用褪黑素可以明顯改善黃體功能，改善妊娠預(yù)后。Eryilmaz等[22]采用褪黑素治療合并睡眠障礙的不孕患者，治療后與未服用褪黑素的對照組相比，睡眠狀態(tài)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但得到的卵母細(xì)胞的平均數(shù)、平均減數(shù)分裂Ⅱ期卵母細(xì)胞數(shù)、G1的胚胎比例顯著高于對照組。研究[23]表明，在促排卵后口服褪黑素能夠顯著增加黃體期孕酮水平，改善黃體功能。Tamura等[24]研究發(fā)現(xiàn)，對進(jìn)行體外受精-胚胎移植技術(shù)(IVF-ET)治療的不孕女性于前次月經(jīng)前第5天口服補(bǔ)充褪黑激素直至取卵日，所獲得優(yōu)質(zhì)胚胎明顯高于未補(bǔ)充褪黑素的對照組。這一點(diǎn)在動(dòng)物試驗(yàn)中也得到了證實(shí)，Wang等[25]在梅花鹿超促排卵治療的研究中發(fā)現(xiàn)，皮下注射應(yīng)用褪黑素顯著提高了血清卵泡刺激素(FSH)水平，LH峰值顯著高于對照組基線水平，顯著降低血清泌乳素水平，其中治療組平均黃體數(shù)量顯著高于對照組。以上諸多研究均從單一褪黑素角度探討了其對LPD的作用。Pacchiarotti等采用褪黑素聯(lián)合肌醇、葉酸對照單純給予肌醇、葉酸治療不孕癥，3個(gè)月后進(jìn)行ICSI治療，治療組獲取成熟卵母細(xì)胞、優(yōu)質(zhì)胚胎獲得率顯著高于對照組。上述研究結(jié)果表明，褪黑素可能參與調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育。

2.2 體外應(yīng)用 哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞有一個(gè)復(fù)雜的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，對于溫度和滲透壓的變化敏感。離體卵母細(xì)胞失去富含抗氧化物卵泡液的保護(hù)，而在低溫貯藏保存條件下，過量產(chǎn)生的活性氧可繼發(fā)ROS從而損傷卵母細(xì)胞[26]，活性氧導(dǎo)致黃體顆粒細(xì)胞分泌孕激素量下降，導(dǎo)致LPD，使妊娠轉(zhuǎn)歸不良，而合并使用褪黑素可解除過氧化氫對黃素化顆粒細(xì)胞對孕酮分泌的抑制作用，改善其預(yù)后。有研究[27]發(fā)現(xiàn)自排卵后8 h，卵母細(xì)胞即開始出現(xiàn)氧化應(yīng)激，并呈時(shí)效相關(guān)的指數(shù)增長，在體外培養(yǎng)人受精卵時(shí)加入1 mmol/L褪黑素干預(yù)，可明顯緩解卵母細(xì)胞的ROS損傷，與未使用褪黑素的對照組相比，治療組發(fā)育到囊胚階段的受精卵數(shù)目明顯增多。Rocha等[27]用不同濃度的褪黑素及FSH進(jìn)行干預(yù)體外培養(yǎng)的山羊排卵前卵泡，結(jié)果表明應(yīng)用褪黑素及FSH有助于保護(hù)山羊排卵前卵泡超微結(jié)構(gòu)的完整，從而改善妊娠預(yù)后。Wei等[29]將凍存的人胚泡278例和停于減數(shù)分裂Ⅰ期卵母細(xì)胞隨機(jī)分為6組以不同濃度的褪黑素進(jìn)行干預(yù)，分別于6、12、18、24、48 h評(píng)估卵子成熟情況，最終發(fā)現(xiàn)劑量為1 nmol/L的褪黑素培育24 h時(shí)可獲得最佳培育效果，而高濃度組培育24 h卵細(xì)胞成熟率最低，提示高濃度的卵泡外褪黑素在一定程度上抑制卵母細(xì)胞的成熟。同期，KK等[30]報(bào)道與其一致。上述研究報(bào)道表明，褪黑素可在體外培養(yǎng)中改善卵母細(xì)胞質(zhì)量。

綜上所述，作為LPD的輔助治療藥物，褪黑素有其獨(dú)特的抗氧化作用及可靠的安全性，在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域擁有廣闊的前景。

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國家科學(xué)自然基金資助項(xiàng)目(81473713)；江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BK20141463)。

周惠芳(E-mail： zhouhuifang2011301@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.35.036

R711.6

A

1002-266X(2016)35-0105-03

2016-06-29)