人牙周膜干細胞膜片的制備

趙魯明，楊玉城，魏立梅，丁剛

(濰坊市益都中心醫院，山東青州 262500)

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人牙周膜干細胞膜片的制備

趙魯明，楊玉城，魏立梅，丁剛

(濰坊市益都中心醫院，山東青州 262500)

目的 制備人牙周膜干細胞(hPDLSC)膜片。方法 刮取接受正畸治療的20例患者完整拔除的前磨牙牙周膜組織，機械分離加酶消化法分離培養人正常牙周膜細胞，采用有限稀釋法克隆培養純化hPDLSC，測算克隆形成率，檢測hPDLSC的體外多向分化潛能。向培養基中添加40 μg/mL維生素C制備hPDLSC膜片，用掃描電鏡及HE染色觀察所制備的hPDLSC膜片的結構。結果 hPDLSC具有較高的克隆形成率，體外誘導具有成骨成脂多向分化潛能。HE染色顯示hPDLSC膜片由3、4層細胞構成，細胞與細胞之間連接緊密，富含細胞外基質。掃描電鏡顯示hPDLSC膜片中hPDLSC排列緊密，細胞外基質豐富。結論 成功制備了hPDLSC膜片。

牙周膜干細胞；細胞膜片；組織再生

牙周病是口腔臨床一種常見疾病，常引起各種程度的口腔功能喪失，最終造成牙齒缺失，嚴重影響患者生活質量。目前傳統的牙周治療方法還不十分理想，牙周治療亟待引入新方法新技術。近年來，隨著組織工程學的不斷發展以及對牙周組織再生和發育機制的進一步了解，通過干細胞介導的牙周組織再生成為一種可能的牙周病治療方式[1]。牙周膜干細胞(PDLSC)是一種牙源性的間充質干細胞，在體外培養條件下能夠多向分化為牙周組織相關性細胞，如成牙骨質細胞、成骨細胞等，是一種可以用于牙周組織再生的干細胞[2]。但目前對于PDLSC在牙周再生中的應用尚存在一些問題，具體表現為缺乏良好的種子細胞復合生物性支架材料、傳統支架材料復合干細胞植入操作困難、移植后種子細胞的存活率低等[3]。細胞膜片技術是近年來新興的一項組織工程學技術，不同于傳統的種子細胞復合支架材料模式，細胞膜片技術采用非酶解的方式獲取干細胞，最大程度保留了細胞自身分泌的細胞外基質，其中含有的豐富的生長因子和信號分子可以促進干細胞生物學特性的發揮，目前已廣泛用于心肌組織、角膜、骨組織以及牙周組織再生中[4]。近年來發現，將PDLSC膜片應用于牙周缺損的修復時，PDLSC膜片能夠良好地再生牙周膜-牙骨質復合體，但是膜片的獲取存在一些問題，如利用溫度反應性培養皿制備膜片時成功率較低、膜片厚度不夠、操作不夠便捷以及成本較高等[5,6]。因此，本研究采用維生素C對人PDLSC(hPDLSC)進行刺激制備hPDLSC膜片。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 α-MEM培養基、胎牛血清、L-抗壞血酸2-磷酸、L-谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素、Ⅰ型膠原酶、Dispase、0.25%胰蛋白酶、PBS緩沖液、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、堿性磷酸酶染色試劑盒。

1.2 hPDLSC分離培養 選擇因正畸治療需要拔除前磨牙到濰坊益都中心醫院口腔科就診的20例患者，年齡16～29歲，全身健康，近期無急慢性感染性疾病，無遺傳病及全身系統性疾病史。經患者知情同意后收集完整拔除的前磨牙，PBS液沖洗，刮取牙根中段1/3區域的牙周膜組織。組織經PBS反復沖洗，組織剪剪碎，置于含3 mg/mL的Ⅰ型膠原酶和4 mg/mL的Dispase的混合液中，37 ℃培養箱消化1 h，過70 μm細胞篩，離心后重懸，并將細胞接種在含15%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中。在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養，每隔2 d換液直至細胞融合達85%，用0.25%胰酶消化并傳代。

1.3 hPDLSC的鑒定

1.3.1 克隆形成率計算 采用有限稀釋法檢測hPDLSC的克隆形成率[7]。原代hPDLSC呈短梭形，胞體豐滿，細胞核較大，核圓形或卵圓形。將原代培養的細胞胰酶消化，充分吹打混勻，制成單細胞懸液，計數，將密度調整為104/mL，按1 mL/孔接種到100 mm培養皿，加入DMEM培養基中，放入37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每3 d換液1次，培養7 d后，將細胞用4%多聚甲醛固定，0.1%甲苯胺藍染色10 min，低倍鏡視野下計數細胞克隆數，大于50個細胞的記作一個克隆，最后統計并計算克隆形成率。培養7 d后可見細胞呈集落樣分布，并形成細胞克隆，傳代后的細胞逐漸變為長梭形，細胞之間排列緊密，甲苯胺藍染色顯示克隆形成率為0.52%±0.04%。

1.3.2 多向分化能力鑒定 ①成骨誘導分化能力：將處于對數生長期的第2、3代hPDLSC消化并制備為細胞懸液，以5×104/mL的密度接種于6孔板內，待細胞增殖至60%左右時，更換為成骨誘導液(含10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10 nmol/L地塞米松和50 mg/L維生素C、15%胎牛血清的α-MEM培養液)繼續培養3周，每3 d換液1次。成骨誘導1周后，PBS清洗細胞，將細胞用95%乙醇固定2 min，PBS清洗2次，利用堿性磷酸酶染色試劑盒進行染色，并進行堿性磷酸酶活性檢測，可見堿性磷酸酶染色明顯陽性，堿性磷酸酶活性明顯增高。在誘導3周后，棄誘導液，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛室溫固定30 min，進行茜素紅鈣結節染色，可見大量鈣結節形成。②成脂誘導分化能力：將處于對數生長期的第2、3代hPDLSC制備成細胞懸液，以5×104個/mL的密度接種于6孔板中，當細胞密度達80%融合時，更換為成脂誘導液(含0.5 mmol/L異丁基-甲基黃嘌呤、10 μg/mL胰島素、0.5 μmol/L氫化可的松、60 μmol/L吲哚美辛、10%胎牛血清的DMEM培養液)并誘導4周，每3 d換液1次，誘導3、4周后進行油紅-O染色，結果顯示為陽性。

1.4 hPDLSC膜片的制備 將處于對數生長期的第3代或第4代hPDLSC用胰酶消化并制成單細胞懸液，調整細胞懸液密度為5×105/mL，將細胞均勻接種至100 mm培養皿，加入10 mL誘導培養液(含40.0 μg/mL維生素C、5 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、15%胎牛血清的α-MEM培養基)，每2 d換液，培養10～14 d，連續動態觀察膜片成熟過程。培養皿底部出現白色膜樣物質，邊緣出現皺褶，說明hPDLSC膜片已形成。將所獲取的hPDLSC膜片用PBS沖洗，在4 ℃下用4%多聚甲醛固定6 h、梯度乙醇脫水、浸蠟，包埋、切片，進行HE染色，光鏡下進行組織學觀察。將獲得的完整的hPDLSC膜片用二甲砷酸鈉緩沖液(pH 7.2)沖洗3次，4 ℃下1%鋨酸固定2 h，雙蒸水沖洗3次后，梯度乙醇依次脫水，CO2臨界點干燥，離子噴金鍍膜，掃描電鏡觀察。

2 結果

培養7 d時，倒置相差顯微鏡下可見hPDLSC排列非常緊密，呈多層交織狀排列，細胞接觸抑制消失，細胞外有大量的細胞外基質；14 d時，肉眼觀察可見hPDLSC膜片形成，膜片從邊緣開始從培養皿分離，用細胞刮刀可以將其從培養皿周邊刮起，最后可獲得完整的hPDLSC膜片。HE染色顯示hPDLSC膜片由3、4層細胞構成，細胞與細胞之間連接緊密，富含細胞外基質。掃描電鏡顯示hPDLSC膜片中hPDLSC排列緊密，細胞外基質豐富。

3 討論

PDLSC在2004年首先被發現，研究[2]表明該類細胞具有干細胞的特點，能夠在體外分化成牙骨質細胞、牙周膜細胞和牙槽骨細胞。并具有較強的骨向分化潛能。成骨相關基因如OCN、ALP、ON、BSP、Col-1等都在PDLSC上有表達[8]，提示PDLSC在牙周組織的再生以及骨組織的再生中可以發揮重要作用。PDLSC在牙周組織工程中一直被認為是最理想的種子細胞之一，以往的研究發現小鼠及大鼠的PDLSC難以大量擴增[9]，但本研究成功分離培養出hPDLSC，證實這些克隆化生長的PDLSC在第4代時仍有一定的克隆形成能力，且具有間充質干細胞的生物學特性及多向分化潛能。

合理有效的細胞移植方式在組織再生中具有重要的作用，影響PDLSC介導的牙周組織再生效果因素有很多[10]，其中干細胞與支架材料的低生物相容性能降低PDLSC生物學功能。目前常見的組織工程技術多是細胞復合支架材料的方式，這種傳統的方式往往采用胰酶消化方法來獲取干細胞，造成了大量的細胞間信號分子和細胞間連接的破壞，影響種子細胞植入后的存活及組織再生效果。同時作為細胞植入載體所使用的天然或人工合成材料在體內移植和降解過程中均會不同程度地引發局部組織的免疫反應和毒性反應，也能影響組織再生效果。因而，近些年來研究者開始尋找不需要支架的組織再生方式進行組織再生。細胞膜片技術最大程度保留了細胞外基質和細胞連接，更好地模擬了細胞的生存微環境，且避免了外源性支架材料的使用，顯示出了廣闊的應用前景[11]。細胞外基質是位于組織中細胞之間的多種成分，包含大量生物活性分子，能夠調控細胞的生物學功能，是維持正常組織生理功能的重要部分[12,13]。目前制備細胞膜片的方式有許多種，但都有不足。其中常見及簡便的方式是使用維生素C進行刺激[14]，維生素C是機體內維持生物學功能的重要的協同因子，它可以促進細胞分泌膠原和其他細胞外基質[15]，在機體的微環境穩態中發揮重要作用。研究顯示，維生素C能夠促進骨髓間充質干細胞(BMSCs)的增殖和DNA合成，抑制細胞分化[16]，抑制端粒酶活性從而減少凋亡，并且能夠上調胚胎干細胞表達多能干細胞標志物Oct4和Sox2[17]。目前尚未有研究報道利用維生素C制備人來源PDLSC膜片。本實驗通過在培養基中添加40 μg/mL維生素C進行誘導，發現hPDLSC從第3天就能明顯增殖，有大量細胞外基質分泌，第7天能見到細胞呈多層交織狀排列，第14天左右膜片成熟，所獲得的膜片不易破損，具有一定物理性能。

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Preparation of human periodontal ligament stem cell sheet

ZHAOLuming,YANGYucheng,WEILimei,DINGGang

(YiduCentralHospitalofWeifang,Qingzhou262500,China)

Objective To prepare the human periodontal ligament stem cell (hPDLSC) sheet. Methods Human periodontal ligament stem cells were isolated and cultured from 20 extracted premolar teeth. ALP staining and red oil O staining were utilized to observe the differential ability of hPDLSC. hPDLSC sheet was prepared by adding 40 μg/mL vitamin C into the culture medium, HE and SEM were used to observe the cell sheet structure. Results In this study, hPDLSC was successfully isolated and cultured; it had high colonic ability and multiple differentiation ability which complied with the characteristics of mesenchymal stem cells. SEM indicated that the cells were arranged closely, and the extracellular matrix was abundant. HE staining showed that the cell sheet was composed of 3 to 4 layers of cells. Cells and cells were closely connected, and rich in extracellular matrix.Conclusion hPDLSC sheet was prepared successfully.

periodontal ligament stem cells; cell sheet; tissue regeneration

國家自然科學基金資助項目(81570945);山東省自然科學基金資助項目(2015ZRB14109)。

丁剛(E-mail: dentistdg@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.35.014

R781.4

A

1002-266X(2016)35-0045-03

2016-04-09)