轉染miR-7類似物的卵巢癌ES-2細胞遷移、侵襲能力及EGFR表達變化

夏芬，胡燕玲，李莉

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院，武漢 430014)

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轉染miR-7類似物的卵巢癌ES-2細胞遷移、侵襲能力及EGFR表達變化

夏芬，胡燕玲，李莉

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院，武漢 430014)

目的 觀察轉染miR-7類似物的卵巢癌ES-2細胞遷移、侵襲能力及表皮生長因子受體(EGFR)表達變化。方法 將卵巢癌ES-2細胞分為觀察組和對照組，觀察組轉染miR-7 類似物，對照組轉染無關序列，繼續培養24 h，用real-time PCR法檢測兩組細胞miR-7，用細胞劃痕實驗檢測兩組細胞遷移能力，用Transwell細胞侵襲實驗檢測兩組細胞侵襲能力，用Western blotting法檢測兩組細胞中EGFR蛋白，用real-time PCR法檢測兩組細胞中EGFR mRNA。結果 觀察組、對照組miR-7相對表達量分別為1.57±0.21、0.13±0.02，劃痕愈合率分別為35.32%±5.43%、84.21%±4.35%，穿膜細胞數分別為(149±28)、(532±54)個，EGFR蛋白相對表達量分別為1.27±0.31、3.65±0.67，EGFR mRNA相對表達量分別為0.13±0.04、0.57±0.15,兩組比較，P均<0.05。結論 轉染miR-7類似物的卵巢癌ES-2細胞miR-7表達上調，同時細胞遷移及侵襲能力下降、EGFR蛋白及mRNA表達降低；推測miR-7表達上調導致了細胞遷移及侵襲能力的下降，miR-7的這一作用是通過下調EGFR表達實現的。

微小RNA-7；基因轉染；卵巢癌；卵巢癌細胞系ES-2；細胞遷移；細胞侵襲；表皮生長因子受體

卵巢癌是婦科惡性常見的惡性腫瘤，在腫瘤致死性疾病中排第5位[1]。轉移仍是卵巢癌復發和患者死亡的主要原因，深入闡明卵巢癌遷移和侵襲的分子機制對提高卵巢癌診治水平具有重要意義。microRNAs(miRNA)是一類長度約為22個核苷酸的非編碼RNA，其可與靶基因的mRNA結合，抑制mRNA的翻譯或降解[2],廣泛參與調節細胞增殖、凋亡、侵襲及轉移等腫瘤生物學過程[3,4]。miR-7由23個核苷酸組成，是一種miRNA。miR-7已被發現與許多原癌基因,如胰島素樣生長因子1受體、表皮生長因子受體(EGFR)、p21活化激酶1和相關的cdc42激酶1等的調控有關[5～7]。卵巢癌組織中miR-7表達下調，但miR-7對卵巢癌遷移、侵襲能力的影響及其機制尚不明確。2014年2月～2016年1月，我們觀察了轉染miR-7類似物的卵巢癌ES-2細胞遷移、侵襲能力及EGFR表達變化，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 卵巢癌ES-2細胞購自中國醫學科學院細胞庫。RPMI1640培養基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自武漢大學醫學院，Lipofectamine2000試劑購自美國Invitrogen公司，Transwell小室購自美國corning公司，Western blotting試劑盒購自武漢博士德生物公司，所用一抗購自Abcam公司，TRIzol購自美國Invitrogen公司，PCR試劑盒購自TaKaRa公司，miR-7類似物、無關序列由廣州銳博生物科技公司合成。

1.2 方法

1.2.1 ES-2細胞分組與miR-7類似物轉染 將ES-2細胞用RPMI1640培養基于37 ℃、5% CO2培養箱中培養、傳代。將細胞隨機分為觀察組和對照組，培養24 h至對數期后，兩組細胞分別采用Lipofectamine2000試劑轉染miR-7類似物、無關序列，轉染后繼續原條件培養24 h。

1.2.2 ES-2細胞miR-7檢測 采用real-time PCR法。采用TRIzol試劑提取上述兩組細胞總RNA，cDNA通過Superscript Ⅱ Reverse Transcriptase (Invitrogen公司)的逆轉錄反應合成。熒光定量PCR采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒，使用ABI公司的熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)進行分析。以U6作為內參，正向引物序列:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以U6小核RNA作為內參，用2-ΔΔCt表示miR-7的相對表達量。

1.2.3 ES-2細胞遷移能力觀察 采用細胞劃痕實驗。將對照組和觀察組細胞培養于6孔板，待生長融合后，用100 μL的滅菌吸引槍頭沿直線用力劃直線，于劃痕后即刻、劃痕后48 h在顯微鏡下測算細胞劃痕面積，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率=(劃痕后即刻的劃痕面積-劃痕后48 h的劃痕面積)/劃痕后即刻的劃痕面積×100%。實驗重復3次，取平均值。

1.2.4 ES-2細胞侵襲能力觀察 采用Transwell細胞侵襲實驗。對照組和觀察組各取2×104個細胞，種于Transwell小室的碳酸磷脂表面，上室BioCoatTM包被Matrigel基質膠，37 ℃培養24 h。取出上層小室，將膜下面的細胞與1%多聚甲醛混合，用0.2%結晶紫溶液染色15 min。用顯微鏡計數進入膜下的細胞數目，在200倍鏡頭下隨機取10個視野，計算平均值。實驗重復3次，取平均值。

1.2.5 ES-2細胞EGFR檢測 ①EGFR蛋白：采用Western blotting法。收集對照組和觀察組細胞，提取細胞總蛋白后，以每孔30 μg總蛋白上樣，電泳、濕法轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。加入EGFR一抗(1∶200)和GAPDH(1∶300)孵育過夜，加入二抗1∶1 000孵育2 h。ECL化學發光，凝膠成像系統顯影。用Quantity One 1-D分析軟件(美國Bio-Rad公司)測定蛋白灰度值。以目的蛋白測定值與GAPDH的比值作為EGFR蛋白的相對表達量。②EGFR mRNA：采用real-time PCR法。操作按試劑盒說明書進行。EGFR正向引物:5′-AGGCACGAGTAACAAGCTCAC-3′，反向引物：5′-ATGAGGACATAACCAGCCACC-3′。內參β-actin正向引物:5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，反向引物：3′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-5′。以β-actin作為內參，用2-ΔΔCt表示EGFR mRNA相對表達量。

2 結果

觀察組、對照組miR-7相對表達量分別為1.57±0.21、0.13±0.02，劃痕愈合率分別為35.32%±5.43%、84.21%±4.35%，穿膜細胞數分別為(149±28)、(532±54)個，EGFR蛋白相對表達量分別為1.27±0.31、3.65±0.67，EGFR mRNA相對表達量分別為0.13±0.04、0.57±0.15，兩組比較，P均<0.05。

3 討論

侵襲與轉移為惡性腫瘤的主要生物學特征，主要是原發部位的腫瘤細胞脫離原發灶，侵襲穿過基底膜并向周圍間質浸潤，進入毛細血管或淋巴管并隨血液循環定植于遠處器官，形成轉移灶。上述過程復雜，受一系列轉移基因、抑制轉移基因、腫瘤新生血管生成、細胞外基質降解、黏附、腫瘤微環境等因素影響[8]。研究[9]發現，miRNA能通過靶向多種原癌基因與抑癌基因，在腫瘤的發生發展中扮演重要作用。miR-7首次于2001年由Lagos-Quintana等[10]發現并報道，由23個核苷酸組成。Kong等[11]發現，miR-7與E-鈣黏蛋白表達呈正相關，與波形蛋白Vimentin表達呈負相關，并可通過靶向FAK基因表達抑制乳腺癌上皮間質轉化。Reddy等[12]報道miR-7可通過靶向下調PAK1的表達，并進而抑制乳腺癌的生長。Webster等[13]報道miR-7可通過靶向抑制EGFR的表達和蛋白激酶B信號通路，調節乳腺癌細胞的增殖和轉移。Chan等[14]報道miR-7可通過靶向結合EGFR mRNA的3′-UTR區抑制肺癌的增殖和轉移。Liu等[15]報道miR-7可通過調節EGFR信號通路抑制神經膠質瘤腫瘤形成。近期研究[16]也表明，約70%的卵巢上皮癌表達活化的EGFR。EGFR的過度表達和活化導致了癌細胞的增殖和遷移，其中包括卵巢癌。EGFR酪氨酸激酶的激活導致了許多胞內信號激活，通過其下游信號通路，如蛋白激酶(AKT)和胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)等，介導細胞增殖、細胞遷移、血管增生、細胞轉移和上皮間質轉化[17]。

本研究結果顯示，觀察組卵巢癌ES-2細胞miR-7相對表達量高于對照組，提示轉染miR-7類似物可以上調卵巢癌ES-2細胞miR-7表達。同時本研究結果顯示，觀察組劃痕愈合率及穿膜細胞數顯著低于對照組，表明轉染miR-7類似物可抑制卵巢癌的遷移及侵襲。觀察組卵巢癌ES-2細胞EGFR mRNA及蛋白顯著低于對照組，提示miR-7與EGFR可能呈負相關。查閱文獻發現miR-7可在乳腺癌、肺癌及神經膠質瘤等多種腫瘤中靶向結合并下調EGFR的表達[6,13,14]，故miR-7抑制卵巢癌遷移和侵襲的作用機制很可能是通過靶向調節EGFR表達而實現的。這與前人在神經膠質瘤中的研究結果相一致。如Kefas等[6]在活體細胞培養和異體腫瘤動物實驗中發現miR-7過表達均可抑制神經膠質瘤的遷移和侵襲。Webster等[13]發現miR-7能作用于EGFR的3′-UTR區域從而抑制其基因表達。

綜上可見，轉染miR-7類似物的卵巢癌ES-2細胞miR-7表達上調，同時細胞遷移及侵襲能力下降、EGFR蛋白及mRNA表達降低；推測miR-7表達上調導致了細胞遷移及侵襲能力的下降，miR-7的這一作用是通過下調EGFR表達實現的。

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李莉(E-mail: liliwuhan8887@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.35.009

R737.31

A

1002-266X(2016)35-0030-03

2016-03-16)