依達拉奉預處理對大鼠腦干缺血再灌注損傷后MDA、SOD的影響

李嬌紅，程錦楠，李小剛

（西南醫科大學附屬醫院：1神經內科；2皮膚科，四川瀘州 646000）

依達拉奉預處理對大鼠腦干缺血再灌注損傷后MDA、SOD的影響

李嬌紅1，程錦楠2，李小剛1

（西南醫科大學附屬醫院：1神經內科；2皮膚科，四川瀘州 646000）

目的：用依達拉奉(EDA)對大鼠預處理，觀察其對大鼠腦干缺血再灌注損傷后丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）表達水平的影響，探討研究EDA對腦干缺血再灌注損傷的保護作用，為臨床應用提供實驗依據。方法：將25只SD大鼠隨機分為3組，即對照組5只、缺血再灌注組和依達拉奉預處理組各10只。根據缺血時間的不同，把缺血再灌注組和依達拉奉預處理組分為缺血1 h再灌注7 h和缺血3 h再灌注5 h兩個亞組，每亞組5只大鼠。其中對照組：暴露基底動脈（BA）第一無分支區和第二無分支區，觀察8 h；缺血再灌注組：用微型動脈夾夾閉基底動脈第一無分支區和第二無分支區，分別使之缺血1 h和3 h，再分別灌注7 h和5 h；依達拉奉預處理組：各亞組實驗前10 min于大鼠尾靜脈注射依達拉奉6 mg/kg，其它同缺血再灌注組。HE染色觀察各組腦干組織的病理改變。測定各組大鼠腦干中MDA及SOD表達水平。結果：在缺血1 h時，與假手術組和預處理組比較，缺血再灌注組MDA含量明顯升高，SOD含量明顯降低，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。在缺血3h時，與假手術組比較，預處理組和缺血再灌注組MDA含量明顯升高，SOD含量明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與預處理組比較，缺血再灌注組MDA含量明顯升高，SOD含量明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論：依達拉奉預處理通過減少MDA含量、增加SOD活性，清除自由基、對抗脂質過氧化等機制，對大鼠腦干缺血再灌注具有一定的保護作用。

依達拉奉；預處理；腦干缺血再灌注損傷；MDA；SOD

世界衛生組織（WHO）報告顯示，腦血管疾病已成為全球成年人第一位致死性疾病和第二位致殘性疾病。因此對腦卒中的預防顯得尤為重要。腦干缺血再灌注損傷是指腦干組織缺血缺氧一段時間后，當血管再通或血流重新恢復時，腦干組織的損傷程度反而較缺血時進一步加重，其癥狀進一步惡化的表現。缺血再灌注損傷是近年來醫學研究中的熱門領域，已被臨床觀察和動物實驗所證實。藥物預處理是缺血預處理的發展趨勢，其既不損傷器官又能產生預處理效果，所以藥物預處理是神經保護的新前途，為缺血再灌注腦損傷的預防提供了一新思路，具有很大的潛在臨床應用價值。相關臨床試驗和實驗研究均表明：依達拉奉（EDA）作為自由基清除劑，對組織缺血再灌注損傷具有強有效的保護作用。其可清除顱內羥基基團，減輕細胞毒性，且可降低急性腦梗死后腦組織炎性標記物的表達，減少繼發性腦缺血后損傷[1]。雖然關于EDA治療腦干梗死的臨床療效觀察已證實其對腦干梗死有保護作用，但關于其在腦干缺血再灌注損傷過程中的保護作用機制的基礎性研究，國內的相關報道仍罕見。因此本文通過比較大鼠腦干缺血再灌注組織中丙二醛（MDA）、超氧化物岐化酶（SOD）的含量與EDA預處理后腦干組織中指標表達的變化，進一步研討和明確依達拉奉預處理對腦干缺血再灌注損傷的影響。

1 材料及方法

1.1 實驗大鼠

準備成年雄性SD大鼠25只，平均體重約300 g。于西南醫科大學動物實驗中心采購。動物飼養5～7 d使大鼠適應實驗室環境。

1.2 主要試劑和儀器

硫酸阿托品；2%戊巴比妥鈉；尼克剎米注射液；梯度乙醇；明礬蘇木精；1%伊紅水溶液；MDA、SOD試劑盒（南京建成生物醫學工程研究所提供）；依達拉奉注射液（南京先聲東元制藥有限公司）。實驗用手術器械；手術顯微鏡；微型動脈夾；自制氣管插管用聚乙烯管；低溫離心機（德國D-63405 Hanau）；玻璃勻漿器；電子天平ES-J（沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司）；隔水式電熱恒溫水箱（上海躍進醫療器械）；照相顯微鏡等。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

25只雄性大鼠隨機分組，其中假手術組5只，缺血再灌注組和依達拉奉預處理組各10只，各亞組5只。缺血再灌注組根據缺血時間不同分為缺血1 h灌注7 h（I1R7）和缺血3 h灌注5 h（I3R5）兩個亞組。依達拉奉預處理組分組同缺血再灌注組，在每亞組實驗前10 min在大鼠尾靜脈處推入依達拉奉6 mg/ kg預處理。假手術組：只分離暴露出基底動脈，不予其它處理，可在實驗中用白熾燈距大鼠30 cm處照射，使其保持體溫。每組實驗觀察至8 h，終止模型后測定各實驗組腦干組織中MDA、SOD含量。

1.3.2 大鼠腦干缺血再灌注模型建立

大鼠行2%戊巴比妥鈉麻醉后取仰臥位，于手術臺上固定頭部及四肢。皮下注射硫酸阿托品使氣管分泌物減少。去毛、消毒后暴露氣管，氣管切開后氣管插管，剪除枕骨基底所附著的肌肉及剪斷兩側枕骨骸處，剪開枕骨基底面，除骨組織，形成骨窗。剪除硬腦膜，去除蛛網膜，小心暴露基底動脈（BA），可清晰顯示基底動脈分支（腦橋支、小腦下前動脈、小腦上動脈及椎動脈），其無分支區分別位于起始處和前、中段移行處即小腦下前動脈前方。缺血再灌注組在BA兩個無分支處分別用微型動脈夾夾閉，維持1 h、3 h，期間予生理鹽水沖泡的紗布覆蓋傷口，之后分別對應7 h、5 h后移除動脈夾，使BA再通形成再灌注。依達拉奉預處理組在夾閉動脈前10 min于大鼠尾靜脈注射依達拉奉6 mg/kg，其余同缺血再灌注組。

1.3.3 術后HE染色、光鏡觀察及MDA、SOD的測定

各實驗組終止觀察后快速斷頭取腦，去除大腦、小腦，將所得的腦干組織塊漂洗、吸干、切片、保存備用。切片脫蠟、染色、分色、沖洗、復染、脫水、封片等制備HE染色切片行常規病理觀察。檢測前取出腦干組織塊，制成10%的組織勻漿，取上清液儲存備用。采用TBA比色法進行測定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性；嚴格按照MDA、SOD試劑盒使用說明來操作，然后計算結果，本實驗由西南醫科大學附屬醫院實驗中心協作完成。

1.4 結果判定

動物模型制作過程中，通過觀察大鼠生命體征及神經癥狀（呼吸節律、瞳孔大小、對光反射靈敏度、眼球震顫及肢體活動等），判斷模型是否制備成功（34只大鼠參與造模，成功率73.5%）。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 HE染色、光鏡觀察（×200）

假手術組：神經細胞、血管等組織結構未見明顯水腫、出血及壞死。缺血再灌注組：I1R7組可見細胞水腫為主；I3R5組細胞水腫明顯，可見血管充血。依達拉奉預處理組：I1R7、I3R5可見細胞水腫，預處理后病理改變較相應缺血再灌注組減輕（圖1～6）。

圖1 正常神經細胞（HE×200）

圖2 正常神經細胞（HE×200）

圖3 缺血再灌注組水腫（I1R7：HE×200）

圖4 缺血再灌注組充血（I3R5：HE×200）

圖5 預處理組水腫（I1R7：HE×200）

圖6 預處理組水腫（I3R5：HE×200）

2.2 大鼠腦干組織MDA含量變化

表1 腦干組織MDA含量測定（nmol/mL）（）

表1 腦干組織MDA含量測定（nmol/mL）（）

注：a與再灌注組比較，P＜0.05；b與假手術組比較，P＜0.05

分組假手術組再灌注組預處理組F P 1 h 6.19±0.70a11.44±1.26 7.25±1.09a36.830 0.001 3 h 6.44±0.70a14.18±0.75 7.84±0.92ab133.818 0.000

從表1可見：在缺血1 h時，缺血再灌注組MDA含量高于假手術組和預處理組，差異有統計學意義（P＜0.05）。在缺血3h時，與假手術組比較，預處理組和缺血再灌注組MDA含量明顯升高，且缺血再灌注組高于預處理組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 大鼠腦干組織SOD含量變化

表2 腦干組織SOD活性的測定（U/mL）（）

表2 腦干組織SOD活性的測定（U/mL）（）

注：a與再灌注組比較，P＜0.05；b與假手術組比較，P＜0.05

分組假手術組再灌注組預處理組F P 1 h 101.83±6.30a89.13±7.03 97.66±4.13a5.917 0.016 3 h 100.39±5.93a85.65±4.91 93.03±4.48ab10.266 0.003

由表2可見：在缺血1 h時，缺血再灌注組SOD含量低于假手術組和預處理組，差異有統計學意義（P＜0.05）。在缺血3 h時，與假手術組比較，預處理組和缺血再灌注組SOD含量明顯降低，且缺血再灌注組低于預處理組，差異均有統計學意義 （P＜0.05）。

3 討論

腦干缺血再灌注的動物模型制作較困難，其原因包括多方面：腦干血供復雜、側枝循環建立豐富、明確單一缺血區困難、與人體腦干結構相似的動物模型少、腦干損傷死亡率高。故本實驗大鼠每亞組采用5只。本實驗結合Hukuba N等[2]、Alkan T等[3]、Fang Cao等[4]的相關方法完成動物模型的建立，用夾閉法阻斷基底動脈第一、第二無分支區，相比其它方法其優點是使腦干具體缺血部位穩定，延髓的血供得到保障，降低了實驗動物的死亡率。研究表明，腦梗死的最佳治療時間窗為急性腦梗死發病后3～6 h以內[5]。而腦梗死治療時間窗經相關研究報道：發病后24 h內是超早期治療的最佳時期[6]。經研究實驗動物腦缺血后再灌注時間窗較人類短，約為人類的1/3～1/2，大約為3 h[7]。因此本實驗缺血時間定在3 h以內，以保證依達拉奉預處理在再灌注損傷的最佳時間段即時間窗范圍左右。

依達拉奉作為特異性自由基清除劑，可有效清除氧自由基、腦中高度細胞毒性的羥基基團、黃嘌呤氧化酶和次黃嘌呤氧化酶等。它是一種捕獲羥自由基（-OH）的活性抗氧劑，可降低羥自由基濃度。依達拉奉具脂溶性特點，比較順利的通過血腦屏障，進入腦脊液。血漿和腦脊液中藥物濃度比率可達到68%，且靜脈給藥后可迅速到達腦內或脊髓中。且其具有改善神經細胞，抑制腦水腫形成,而不影響血小板的功能[8]。據相關文獻報道：予以依達拉奉10 mg/kg經尾靜脈注射效果優于6 mg/kg靜注[9]，故本實驗采用實驗前10 min，予以依達拉奉10 mg/kg劑量預處理。目前依達拉奉已廣泛應用于腦缺血再灌注損傷中，大量的基礎研究及臨床試驗已證實其可緩解腦水腫、抑制遲發性神經細胞死亡，機制可能為清除自由基及其引發的脂質過氧化，從而達到改善神經缺損癥狀及臨床表現的作用。總之，依達拉奉通過清除自由基，抑制脂質過氧化，抑制腦細胞、血管內皮細胞、神經細胞的氧化損傷及抑制遲發性神經元死亡等機制，阻止腦水腫和腦損傷的進展。因此，依達拉奉作為預處理藥物，是比較適合于臨床缺血性腦血管疾病的預防和改善預后的，在確保安全的前提下，對缺血性腦血管疾病的高危人群亦有一定的實用價值。目前，雖然研究已證實，依達拉奉預處理可減少大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織的損傷，對腦組織有保護作用，且依達拉奉預處理可減輕心肌、骨骼肌、肝臟、腸等器官組織的缺血再灌注損傷[10-11]，但其對腦干缺血再灌注損傷影響的基礎實驗性研究仍較缺乏。故本實驗主要研究探討依達拉奉預處理對大鼠腦干缺血再灌注損傷保護機制的影響。

在腦干缺血再灌注損傷機制中，大量自由基的產生是其主要因素之一。腦干組織中局部缺血、缺氧，血管阻塞、破裂，紅細胞變性、壞死等都可刺激生成自由基，自由基的產生可誘導三大物質（脂質、蛋白質和核酸）過氧化，細胞膜受損。氧自由基，特別是超氧自由基是組織器官局灶性缺血再灌注后細胞水腫和凋亡的主要病因。而神經細胞更易受到氧自由基的攻擊，因其細胞膜富含膽固醇及多價不飽和脂肪酸。氧自由基與生物細胞膜中不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，其代謝產物即為丙二醛（MDA），因此測定組織中MDA的含量即可間接反映組織中自由基的含量及脂質過氧化的程度。故腦干組織MDA含量越高，氧自由基水平也越高，組織損害越嚴重。超氧化物歧化酶（SOD）是一種帶負電荷的金屬蛋白酶，能在生物體內通過歧化的方式清除氧自由基，減少自由基與其他物質的氧化，從而保護生物體免遭自由基的攻擊[12]，因此檢測SOD表達水平的高低可間接反應機體清除氧自由基的能力，腦干組織SOD活力越高，自由基水平越低，而組織損傷越輕，即腦干組織SOD活力高低與組織損傷程度成反比。本實驗中，腦干組織MDA含量缺血再灌注組較假手術組顯著升高，且隨缺血時間延長，MDA含量逐漸增高，即腦干再灌注損傷越嚴重。依達拉奉預處理組MDA含量也較假手術組高，與缺血再灌注組相比均下降，以缺血1 h再灌注7 h明顯，即依達拉奉預處理后，灌注損傷程度減輕。而腦干組織SOD活性，缺血再灌注組較假手術組對應時間點降低；依達拉奉預處理組中依達拉奉預處理后較缺血再灌注組的SOD活性升高明顯。從中說明，依達拉奉預處理后，缺血3 h內再灌注損傷都有一定程度的緩解，其中缺血時間越短緩解越明顯。

本實驗研究發現，大鼠腦干缺血再灌注依達拉奉預處理可增加SOD活性、減少MDA含量，對大鼠腦干缺血再灌注損傷有較好的保護作用，其機制可能與清除自由基，對抗脂質過氧化等有關。

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（2016-01-20收稿）

Effect of Edaravone pretreatment on MDA and SOD of brainstem after ischemical reperfusion injury in rats

Li Jiaohong1，Cheng Jinglan2，Li Xiaogang11Department of Neurology；2Department of Dermatology，the Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Luzhou 646000，Sichuan Province，China

Objective：To evaluate the protective effect of Edaravone on brainstem after ischemia/reperfusion injury and to provide experimental evidence for clinic,rats were pretreated with Edaravone and its effect on MDA and SOD were studied.Methods：25 SD rats used in experimental animals were divided into 3 groups at random: sham operation group，brainstem ischemia reperfusion group and Edaravone pretreatment group（n=10）.According to different ischemia time period,rats in ischemia/reperfusion group and Edaravone pretreatment group were further divided evenly into ischemia 1 h/reperfusion 7 h and ischemia 3 h/reperfusion 5 h subgroups,respectively. The 1st and the 2nd basilar artery without branch areas were exposed,and animals were observed without any treatment for 8 h in normal group,the arteries were clamped with Micro-bulldog clamp to create ischemia for 1 h/ reperfusion 7 h（5 animals）and ischemia for and 3 h/reperfusion 7 h （5 animals）respectively in ischemia reperfusion group,and animals in Edaravone pretreatment group were given Edaravone（6 mg/kg）by tail vein injection 10 min before ischemia/reperfusion as described in ischemia/reperfusion group.The histology of brainstems after HE staining were compared,the brainstem tissues at various stages was observed by light microscope at 200 magnification.The activities of SOD and the contents of MDA at various subgroups were measuredwith spectrophotometry.Results:When the time on ischemia 1 h,compared with the normal group and pretreatment group,the contents of MDA were significantly increased and the contents of SOD were obviously decreased in ischemia reperfusion group,the differences all had statistical significance（P＜0.05）.When the time on ischemia 3 h,compared with the normal group,the contents of MDA were significantly increased and the contents of SOD were obviously decreased in pretreatment group and ischemia reperfusion group,the differences all had statistical significance（P＜0.05）;Compared with the pretreatment group,the contents of MDA were significantly increased and the contents of SOD were obviously decreased in ischemia reperfusion group,the differences all had statistical significance（P＜0.05）.Conclusion：Edaravone played a tremendous and definite role in ischemia reperfusion injury of brainstem in rats.Its mechanism has to do with the reduced levels of MDA,the increased activity of SOD,the removal of oxyradicals,and the inhibited overoxidation of lipid.

Edaravone；Pretreatment；Brainstem ischemical reperfusion；MDA；SOD

R743

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.02.005

李嬌紅（1986-），女，碩士，醫師。E-mail:61752273@qq.com