甘油對冰凍解凍紅細胞質量的影響探討

紀宏革，王　麗，胡　喬，羅紅林

(鎮江市中心血站，江蘇鎮江 212004)

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·經驗交流·

甘油對冰凍解凍紅細胞質量的影響探討

紀宏革，王麗，胡喬，羅紅林△

(鎮江市中心血站，江蘇鎮江 212004)

摘要:目的比較兩種方法制備冰凍解凍去甘油紅細胞質量差異。方法隨機取2～6 ℃保存6 d內的RH陰性去白細胞懸浮紅細胞60袋，應用ACP215全自動血細胞處理儀制備甘油化紅細胞，-80 ℃冰箱保存1～24個月，其中30袋去甘油冰凍保存,30袋不去甘油冰凍保存，然后取出于37～40 ℃水浴快速融化后，選擇ACP215全自動血細胞處理儀去甘油程序進行去甘油洗滌處理，檢測冰凍解凍去甘油紅細胞的質量指標，并與國家標準進行比較。結果兩種方法制備的冰凍解凍去甘油紅細胞其血紅蛋白水平、游離血紅蛋白濃度、甘油殘余量和細菌培養試驗均滿足《全血及成分血質量要求(GB18469-2012)》。結論兩種方法均可制備符合國家標準的冰凍解凍去甘油紅細胞。但從臨床搶救角度看，采用冰凍前去甘油的方法，可以為臨床搶救爭取約30 min的時間。

關鍵詞:甘油;冰凍紅細胞;RH陰性

自從1970年有研究者將甘油作為保護劑冰凍保存紅細胞用于人體輸血并獲得成功以來,RH陰性冰凍解凍去甘油紅細胞逐漸在臨床輸血治療中得到推廣使用。利用ACP215全自動血細胞處理儀對兩種冰凍紅細胞進行去甘油洗滌，并對兩種方法制備的冰凍解凍去甘油紅細胞質量進行檢測，取得了較好效果[1]，現報道如下。

1材料與方法

1.1材料RH陰性去白細胞懸浮紅細胞(1.5 U或2.0 U，共計60袋，本站制備)，800 mL六珠袋、57%甘油和9%NaCl(北京博德桑特公司)、0.9%NaCl(山東威高公司)，ACP 215全自動血細胞處理儀和配套的REF225甘油化耗材、REF235和REF236去甘油化耗材(美國Haemonetics公司)，-80 ℃冰箱(美國FORMA公司)，BECKMAN J6-MI離心機(美國BECKMAN公司)，無菌接管機(德國費森尤斯公司)，庫爾特血細胞計數儀(美國庫爾特公司)，B-D細菌培養及檢測系統(美國B-D公司)，恒溫水浴箱(江蘇金壇天競公司)。

1.2方法

1.2.1紅細胞甘油化和低溫冰凍保存

1.2.1.1紅細胞與甘油連接取2～6 ℃保存6 d內的RH陰性去白細胞懸浮紅細胞60袋，3 200 r/min離心12 min，去上清后紅細胞與800 mL六珠袋用無菌接駁機接駁，將紅細胞轉移至六珠袋中。

1.2.1.2紅細胞甘油化選擇甘油化程序，安裝REF225甘油化耗材，無菌接駁紅細胞袋和甘油袋，并將紅細胞袋固定于搖床上，設定甘油加入量(1 U紅細胞加入160 mL甘油)，啟動紅細胞甘油化程序，將甘油由慢到快加入到紅細胞袋中，邊加邊振蕩，以使紅細胞和甘油充分混勻。甘油加完后排除袋中空氣。

1.2.1.3紅細胞冰凍保存將甘油化紅細胞在室溫下靜置30 min后， 2 000 r/min，20～24 ℃離心6 min，分離去上清(100～150 mL)，混勻甘油化紅細胞后將血袋水平放入紙盒，-80 ℃冰箱冰凍保存，如此共制備30袋甘油化冰凍紅細胞；另外30袋甘油化紅細胞不離心去甘油，室溫靜置30 min后裝盒直接放-80 ℃冰箱冰凍保存。注意紅細胞冰凍時不可疊加放置。

1.2.2冰凍紅細胞去甘油洗滌

1.2.2.1冰凍紅細胞的解凍將冰凍紅細胞從-80 ℃冰箱中取出后迅速完全浸入37～40 ℃恒溫水浴箱中，快速晃動冰凍紅細胞至完全融化，并使其溫度在20～24 ℃。注意在解凍過程中不能用手捏冰凍紅細胞，另外要保持水溫在37～40 ℃。

1.2.2.2紅細胞去甘油洗滌選擇去甘油程序，安裝去甘油耗材(1.5 U紅細胞用REF235，2 U紅細胞用REF236)，將解凍的紅細胞(已去甘油)與去甘油化耗材紅色管路無菌接駁；未去甘油的2 500 r/min離心10 min，去上清后無菌連接，血袋固定于搖床上。9%濃NaCl溶液與藍色管路相連，0.9%NaCl溶液與黃色管路相連，輸入紅細胞重量，設定加入9%濃NaCl溶液量(1.5 U紅細胞用120 mL,2 U紅細胞用160 mL)，其他參數按默認值進行，啟動ACP215。

1.2.2.3紅細胞重新懸浮當去甘油洗滌結束后，ACP215自動添加0.9%NaCl溶液懸浮解凍紅細胞(2 U解凍紅細胞需另加入60 mL 0.9%NaCl溶液)，并自動打印去甘油洗滌結果。

1.2.3冰凍解凍去甘油紅細胞檢測用血細胞計數儀檢測血紅蛋白含量，鄰聯甲苯胺法檢測游離血紅蛋白，過碘酸鈉法檢測甘油殘余量[2]，B-D細菌培養及檢測系統進行細菌培養和檢測。

1.2.4冰凍解凍去甘油紅細胞質量標準《全血及成分血質量要求(GB18469-2012)》要求“冰凍解凍去甘油紅細胞”的質量標準為1.5 U容量為(300±30) mL，2 U容量為 (400±40) mL，血紅蛋白為16 g/L，游離血紅蛋白小于或等于1 g/L，殘留白細胞小于或等于1×107/U，甘油殘余量小于或等于10 g/L。

2結果

兩種方法制備的冰凍解凍去甘油紅細胞其血紅蛋白水平、游離血紅蛋白濃度、甘油殘余量和細菌培養試驗等均滿足《全血及成分血質量要求(GB18469-2012)》。見表1，由于采用去白細胞懸浮紅細胞為冰凍紅細胞來源，故未做殘留白細胞測定，另外用REF235解凍紅細胞容量為275 mL,用REF236容量為325 mL，細菌培養試驗均為無菌生長。

表1　　冰凍解凍去甘油紅細胞質量(g/L)

3討論

由于我國漢族人群中RH陰性比例0.3%～0.4%[3]，臨床如果需要RH陰性血液時，從無償獻血者RH陰性稀有血型庫中臨時招募采集到供應臨床，至少需要4個小時以上的時間，再加上現在國家提出對所有供應的血液要進行核酸檢測，這無形中以增加了血液供應臨床的時間。據研究者預測，如果全面開展血液核酸檢測，現在這個供應時間至少將要有8個小時以上，有許多RH陰性的患者可能由于不能及時得到所需的血液而失去搶救的機會[4]。作為采供血機構，在街頭或單位開展獻血招募和血液采集時，由于受到環境和條件的限制，對獻血者的RH血型是不做檢測，只有當血液采集回血站后再經過儀器設備進行檢測，確定獻血者是否是RH陰性血型。由于平時RH陰性血液在臨床上使用量較少，所以存在著當血站2～6 ℃保存的RH陰性血液較多時，臨床不一定就需要，同時也存在著ABO血型不同情況，因而易造成血液的過期報廢；另外存在著臨床急需RH陰性血液，血站沒有2～6 ℃保存的RH陰性血液的情況，造成血液不能及時供應。紅細胞冰凍保存技術的發明和應用，很好地解決了這個問題，這樣既避免了平時采集的RH陰性血液，由于臨床沒有使用而造成的過期報廢，又能在臨床急需時保證及時供應。

甘油作為紅細胞內低溫保護劑，其可降低紅細胞在冷凍過程中電解質濃度減少，防止細胞膜脂蛋白復合物的變性及類脂質的丟失，從而避免溶血的發生；甘油的存在可避免紅細胞冷凍時冰晶對細胞膜及細胞結構的機械損傷[5]。選擇在紅細胞中加入甘油，室溫平衡30 min后經過2 000 r/min、20～24 ℃輕離心6 min的方法，主要是去除被甘油置換出來的水分，其對紅細胞內的甘油濃度沒有什么影響。另外認為現行的1U紅細胞加入160 mL甘油的方法不是很科學，由于存在著個體差異，每單位紅細胞量是不一樣的，執行加一樣標準的甘油可能存在有部分比例不恰當，甘油和紅細胞的最適比例為1.6∶1；加9%濃NaCl溶液也存在同樣的情況，這將是以后研究探討的方向。

采用冰凍保存前去甘油制備冰凍解凍去甘油紅細胞，既可以縮短紅細胞冰凍和解凍的時間，減少紅細胞的溶解破壞，同時也能減少解凍后去甘油洗滌時間，可為臨床搶救患者爭取到更多時間。

參考文獻

[1]靳鵬,劉安,曹偉，等.新型冰凍紅細胞洗滌機洗滌效果的研究[J].中國輸血雜志,2005,18(3):212-213.

[2]中華人民共和國衛生部.血站技術操作規程(2012版)[M].北京：人民衛生出版社,2012:51-52.

[3]安萬新,于衛建.輸血技術學[M].北京:科學技術文獻出版社，2010:64.

[4]趙陽,黎世杰,陳揚凱.改進洗血儀程序用于制備冰凍紅細胞[J].中國輸血雜志,2005,18(3):214-215.

[5]李靜文,沈瑞.冰凍紅細胞技術及其應用的研究進展[J].國際檢驗醫學雜志,2013,34(11):1414-1415.

(收稿日期：2015-10-23)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.04.062

文獻標識碼：B

文章編號：1673-4130(2016)04-0564-02

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