維吾爾醫(yī)學(xué)異常黑膽質(zhì)體液結(jié)腸癌患者腸道菌群的分布情況研究*

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·論著·

維吾爾醫(yī)學(xué)異常黑膽質(zhì)體液結(jié)腸癌患者腸道菌群的分布情況研究*

阿孜爾古麗·阿布都克日木1，阿布都哈巴爾·阿布都克日木2,馬蘭英3，

艾力江·買(mǎi)買(mǎi)提明4，孫玉萍1，陳鋒1，王紅英1，德力夏提·依米提1△

(1．新疆醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室，新疆烏魯木齊 830011；2.和田師范專(zhuān)科學(xué)校理學(xué)院生物教研室，

新疆和田 848000;3.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院消化內(nèi)科，新疆烏魯木齊 830011;

4.新疆維吾爾醫(yī)學(xué)專(zhuān)科學(xué)校醫(yī)療系內(nèi)科教研室，新疆和田 848000)

摘要:目的通過(guò)先進(jìn)的分子生物學(xué)方法分析維吾爾醫(yī)學(xué)異常黑膽質(zhì)結(jié)腸癌患者腸道菌群分布情況及多樣性。方法對(duì)結(jié)腸癌患者進(jìn)行維吾爾醫(yī)學(xué)體液分型并挑取其中異常黑膽質(zhì)患者，采集患者糞便樣品，提取細(xì)菌總DNA并設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物擴(kuò)增16S rDNA的V6～V8可變區(qū)進(jìn)行變形梯度凝膠電泳(DGGE)，從DGGE指紋圖譜中比較各個(gè)結(jié)腸癌患者腸道菌群分布情況。結(jié)果通過(guò)試驗(yàn)得到了維吾爾族異常黑膽質(zhì)結(jié)腸癌腸患者腸道菌群結(jié)構(gòu)特征的DNA指紋圖譜，從指紋圖譜上選擇一些特異性條帶切下來(lái)回收，測(cè)序，測(cè)序出來(lái)的序列在基因庫(kù)進(jìn)行比對(duì)做出進(jìn)化樹(shù)了解菌群之間的親緣性。結(jié)論異常黑膽質(zhì)結(jié)腸癌患者腸道菌群基因序列的親緣性結(jié)果顯示腸道菌群的多樣性明顯少其中腸道優(yōu)勢(shì)菌比例低。

關(guān)鍵詞:維吾爾醫(yī)學(xué)；異常黑膽質(zhì)；結(jié)腸癌；腸道菌群

維吾爾醫(yī)學(xué)理論體系中，異常體液分型是治療疾病的主要因素，在治療疾病的過(guò)程中起著非常重要的作用[1-2]，健康人體的體液在結(jié)構(gòu)和功能上處于平衡狀態(tài)，體液異常變化會(huì)導(dǎo)致體液失調(diào)，進(jìn)而引發(fā)各種疾病，尤其是異常黑膽質(zhì)的出現(xiàn)是導(dǎo)致疾病的主要原因之一[3-4]，維吾爾醫(yī)學(xué)臨床研究發(fā)現(xiàn)80%以上的腫瘤是由異常黑膽質(zhì)性體液質(zhì)產(chǎn)生的，可見(jiàn)異常黑膽質(zhì)性體液與腫瘤是密切相關(guān)的。與其他異常體液質(zhì)相比，它的致病性、危險(xiǎn)性、惡性程度最高，在難治性疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中也起主導(dǎo)作用。腸道菌群與人類(lèi)的健康、疾病狀況息息相關(guān)，它不僅能降解食物中不可消化的營(yíng)養(yǎng)成分，提供宿主維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還能促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的分化與成熟，激活腸道免疫系統(tǒng)以及調(diào)節(jié)宿主能量存儲(chǔ)與代謝。正常情況下腸道菌群保持著共生和拮抗關(guān)系，從消化、營(yíng)養(yǎng)吸收、能量供應(yīng)、脂肪代謝、免疫調(diào)節(jié)、藥物代謝和毒性等諸多方面影響人和動(dòng)物的健康狀況[5-7]。目前越來(lái)越多的研究者認(rèn)識(shí)到維吾爾醫(yī)學(xué)治療體系結(jié)合到腸道微生態(tài)研究的重要意義。

1資料與方法

1.1一般資料在新疆維吾爾自治區(qū)腫瘤醫(yī)院選擇18例結(jié)腸癌患者，并按照體液分型診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷為異常黑膽質(zhì)型體液質(zhì)[8]。異常黑膽質(zhì)型體液為面色萎白而發(fā)干，唇色淡白而枯燥，舌質(zhì)淡捫之澀,舌形瘦,舌涎少,舌苔薄白而不潤(rùn),大便干結(jié)而色淡不臭,小便清而短少。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～75歲；(2)維吾爾族；(3)對(duì)本研究知情同意者；(4)性別不限；(5)臨床診斷為結(jié)腸癌術(shù)前患者。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)有腦血管疾病、高血壓、糖尿病、肝臟疾病、傳染病；(2)未化療、放療患者；(3)術(shù)后患者;(4)近期(6周內(nèi))接受抗菌藥物及微生態(tài)制劑治療者。

1.2儀器與試劑QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒購(gòu)自Qiagen生物科技有限公司,2×Taq PCR MasterMix；2×Taq PCR MasterMix 購(gòu)自上海生物科技有限公司；PCR純化試劑盒購(gòu)自上海生物科技有限公司；丙烯酰胺、去離子甲酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、尿素購(gòu)自Sigma；四甲基乙二胺(TEMED)購(gòu)自Promega；SYBR GreenⅠ、100%甘油、2%二甲苯氰、2%溴芬蘭、冰醋酸購(gòu)自北京百泰克生物科技有限公司。PCR引物委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成，主要儀器：凝膠成相系統(tǒng)(GelDoc2000型)、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、DCodeTM System(美國(guó)Bio-Rad有限公司)。

1.3方法

1.3.1總DNA的提取參照 QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒說(shuō)明，提取糞便標(biāo)本細(xì)菌總DNA并測(cè)定濃度后稀釋為40 ng/μL，-20 ℃保存為后續(xù)試驗(yàn)做準(zhǔn)備。

1.3.26SrDNA V6-V8區(qū)PCR擴(kuò)增糞便細(xì)菌的V6-V8區(qū)通用引物F968f-GC(5′-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3′)和R1401(5′-CGG TGT GTA CAA GAC CC-3′)[9-10]委托上海生工生物公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μL)：引物各1 μL(10 mmol/L)，DNA模板3 μL，2×PCR TaqMix 12.5 μL，加ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s；62.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。在第1輪PCR之后為了減少PCR過(guò)程中異源DNA產(chǎn)物影響后續(xù)的DGGE指紋圖譜的質(zhì)量，將PCR產(chǎn)物稀釋10倍后，將其作為模板再進(jìn)行第2輪只有5個(gè)循環(huán)的修復(fù)PCR擴(kuò)增，用2.0%瓊脂糖凝膠電泳30 min，用凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.3.3DGGE指紋圖譜分析使用美國(guó)Bio-Rad有限公司的DCodeTM System進(jìn)行變形梯度凝膠電泳，采用濃度為8%聚丙烯酰胺、乙二胺四乙酸(EDTA)、變性濃度梯度范圍25%～75%(100%變性溶液對(duì)應(yīng)20 mL 40%丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺，42 g尿素，40 mL去離子甲酰胺)取改良后的PCR產(chǎn)物300 ng等體積與凝膠載樣品染液混勻，放入加樣孔后放入電泳槽中50 V電壓電泳30 min后改為150 V電泳240 min然后用0.01%SYBR Green 1染色膠45 min，每次15 min分三次染色膠然后在UVI成像儀照膠。

1.3.4切膠回收純化及測(cè)序在DGGE指紋圖譜膠中選擇一些共有的和差異性明顯的條帶用無(wú)菌刀片切下來(lái)，切下來(lái)的DNA條帶放在無(wú)菌、干燥的1.5 mLEp管中，再用雙氧水水反復(fù)清洗再用無(wú)菌牙簽搗碎使膠中的DNA完全釋放出來(lái)，加20 μL雙氧水放置4 ℃冰箱16 h左右，以上述提出來(lái)的DNA作為模板將原帶GC夾子的反向引物去除GC夾子，引物序列分別為F968f 5′-GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3′，R1401(5′-CGG TGT GTA CAA GAC CC-3′) PCR的反應(yīng)體系和程序同上述進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用凝膠回收試劑盒回收、將回收的PCR產(chǎn)物送北京天根生化科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序出來(lái)的序列利用基因庫(kù)中BLAST進(jìn)行比對(duì)，并將相似性大于95%以上的序列用MEGA4軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，揭示親緣性關(guān)系并找出優(yōu)勢(shì)細(xì)菌序列。

2結(jié)果

2.1腸道菌群16SrDNA V6-V8區(qū)PCR產(chǎn)物鑒定利用2%瓊脂糖凝膠電泳以提取的DNA稀釋作為模板，PCR擴(kuò)增目的基因，圖1顯示，鑒定1～10號(hào)標(biāo)本的PCR產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小約為480 bp左右，未見(jiàn)到非特異性擴(kuò)增，DNA樣品完整性好。

2.2腸道菌群DGGE電泳圖與測(cè)序結(jié)果每一個(gè)樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物重復(fù)多次進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，經(jīng)相互比較，結(jié)果基本一致，證實(shí)本試驗(yàn)的重復(fù)性和準(zhǔn)確性良好，異常黑膽質(zhì)型結(jié)腸癌患者腸道菌群結(jié)構(gòu)DGGE指紋圖譜見(jiàn)圖2所示(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)，均表現(xiàn)出個(gè)體的條帶數(shù)量稀少，而且每個(gè)條帶的亮度也有區(qū)別，有共同的條帶，也有相互有差異的條帶，這表明在患者腸道中存在量和種類(lèi)不一樣的細(xì)菌。圖譜中每一個(gè)條帶都代表一種細(xì)菌，而且條帶的亮度表明細(xì)菌量的多少，圖譜中可以看到每一個(gè)研究對(duì)象腸道中細(xì)菌的種類(lèi)、數(shù)量和優(yōu)勢(shì)菌的分布都不一樣，有些個(gè)體出現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)菌在別的個(gè)體的腸道中沒(méi)有出現(xiàn)或者量比較少，有些細(xì)菌在個(gè)體中分布去向一致，因此在圖譜中選擇具有代表性的，差異性大的一些條帶進(jìn)行切膠回收，純化進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序顯示維吾爾族異常黑膽質(zhì)結(jié)腸癌患者腸道菌群中擬桿菌屬和梭桿菌屬數(shù)量較多。所得的序列在GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)測(cè)序結(jié)果，基因文庫(kù)比對(duì)相似性。

M：DNA標(biāo)記物；1～10號(hào)：PCR擴(kuò)增目的基因產(chǎn)物。

圖1PCR產(chǎn)物電泳圖

2.3異常黑膽質(zhì)結(jié)腸癌患者腸道總菌群DGGE圖譜的相似性聚類(lèi)分析目的片段經(jīng)基因測(cè)序后進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，同源性大于95%的用MEGA4軟件構(gòu)建維吾爾醫(yī)異常黑膽質(zhì)型結(jié)腸癌患者腸道菌群進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)。

3討論

人的腸道中存在著大約1014個(gè)腸道菌群，由1 000多種微生物組成，占機(jī)體細(xì)胞總量的10倍，是人和動(dòng)物體最龐大而復(fù)雜的生物群落，腸道菌群又被稱(chēng)為“超級(jí)生物體”[11]，正常情況下腸道菌群保持著良好的動(dòng)態(tài)平衡，一旦破壞動(dòng)態(tài)平衡可能與很多疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，比如肥胖、腸道各種炎性疾病、造血功能障礙、肝硬化合并腸功能紊亂、抗菌藥物相關(guān)性腹瀉、習(xí)慣性便秘、腸易激綜合征等[12]，因此腸道菌群很多方面影響人和動(dòng)物的健康狀況，現(xiàn)在已經(jīng)把腸道菌群看作為宿主的一個(gè)重要組成部分。

DGGE最初是應(yīng)用在DNA 片段中的出現(xiàn)點(diǎn)突變的鑒定研究中，此后該技術(shù)被廣泛用于各種微生物種群檢測(cè)的研究，目前已經(jīng)發(fā)展成為研究微生物種類(lèi)、數(shù)量、分類(lèi)等的一種重要的分子生物學(xué)方法。有研究者則分別應(yīng)用此技術(shù)分析4位受試者結(jié)腸中雙歧桿菌、乳酸桿菌及其他乳酸菌的分布和中老年人糞便菌群多樣性研究。DGGE技術(shù)多年以來(lái)一直用于腸道菌群多樣性研究中，是一種比較成熟、先進(jìn)的分子生物學(xué)方法。

本研究采用DGGE技術(shù)針對(duì)維吾爾醫(yī)學(xué)異常黑膽質(zhì)結(jié)腸癌患者腸道菌群16SrDNA V6-V8可變區(qū)進(jìn)行菌群分布情況、多樣性、個(gè)體之間細(xì)菌差異性、檢測(cè)出來(lái)的細(xì)菌序列相似性等整體相關(guān)性研究。更為全面地探討維吾爾醫(yī)學(xué)異常黑膽質(zhì)結(jié)腸癌患者腸道菌群的變化趨勢(shì)，同時(shí)為維吾爾醫(yī)學(xué)體液質(zhì)理論以及維吾爾醫(yī)學(xué)疾病診斷提供了一些線(xiàn)索。在PCR-DGGE圖譜上能夠直觀(guān)地表現(xiàn)出個(gè)體差異，同時(shí)腸道總菌群UPGMA相似性聚類(lèi)分析顯示出腸道總菌群的同源性存在差異，研究中獲得維吾爾醫(yī)學(xué)異常黑膽質(zhì)結(jié)腸癌患者腸道細(xì)菌分布情況及腸道細(xì)菌指紋圖譜，此圖譜顯示異常黑膽質(zhì)結(jié)腸癌患者腸道菌群多樣化，并且個(gè)體之間具有相似性，腸道中存在不同種類(lèi)的細(xì)菌，再?gòu)膱D譜中把每一種條帶切下來(lái)純化克隆檢測(cè)基因序列的相似性對(duì)比，并用相似性大于95%以上的基因序列做樹(shù)狀圖分析及鑒定異常黑膽質(zhì)結(jié)腸癌患者中具有豐富的擬桿菌屬和梭桿菌屬。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)很多不可培養(yǎng)的細(xì)菌屬，并對(duì)其種屬親緣程度進(jìn)行了分析，這些不可培養(yǎng)的腸道細(xì)菌與優(yōu)勢(shì)細(xì)菌親緣性比較近，也有個(gè)別的細(xì)菌親緣性比較遠(yuǎn)，將加大樣本量進(jìn)一步研究異常黑膽質(zhì)結(jié)腸癌患者腸道菌群中的其他優(yōu)勢(shì)菌并與這些優(yōu)勢(shì)菌的分布與體液質(zhì)的關(guān)系，是細(xì)菌引起了這些體液的分布還是體液決定了這些優(yōu)勢(shì)菌的分布，這些因果關(guān)系還有待進(jìn)一步鑒定。

參考文獻(xiàn)

[1]易沙克江.中國(guó)醫(yī)學(xué)百科全書(shū)：維吾爾醫(yī)分卷(維文)[M].烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1995:17-33.

[2]買(mǎi)買(mǎi)提明·沙比爾.維吾爾醫(yī)學(xué)診斷學(xué)[M].烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1993:135-148.

[3]哈木拉提·吾甫爾.維吾爾醫(yī)學(xué)氣質(zhì)體液論及其現(xiàn)代研究[M].烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，2003:44-52.

[4]阿不都熱依木·玉蘇甫，李林，哈木拉提·吾甫爾，等.維醫(yī)異常體液分型及其與氧化-抗氧化系統(tǒng)關(guān)系的研究[J].中國(guó)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2004,10(8)：61-63.

[5]Turnbaugh PJ，Hamady M，Yatsunenko T，et al.A core gut microbiome in obese and lean twins[J].Nature，2009，457(7228):480-484.

[6]Maia MR，Chaudhary LC，Bestwick CS，et al.Toxicity of unsaturated fatty acids to the biohydrogenating ruminal bacterium，Butyrivibrio fibrisolvens[J].BMC Microbiol，2010，18(1):10-52.

[7] Gill SR，Pop M，Deboy RT,et al.Metagenomic analysis of the human distal gut microbiom[J].Science,2006，312(5778):1355-1359.

[8]Upur Halmurat.Theory of MIZAJ and HILIT in Uighur medicine and itsmodern study[M].Urumqi:Xinjiang Science，Technology and Sanitation Press，2003.

[9]Backhed F，Sonnenburg JL，Peterson DA，et al.Host-bacteria mutuaism in the human intestine[J].Science，2005，307(5717):1915-1920.

[10]Fillon M，Novinscak A，Decoste NJ.Characterization of bacterial and fungal communities in composted biosolids over a year period using denaturing gradient gel electrophoresis[J].Can J Microbiol，2009，387(1):375-387.

[11]曾波,鐘榮珍,譚支良,等.腸道微生物多樣性與能量代謝調(diào)控及肥胖關(guān)系的研究進(jìn)展[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2008,20(8):415-417.

[12]吳曉康，徐紀(jì)茹，張旭燕，等.2 型糖尿病患者腸道擬類(lèi)菌屬和雙歧桿菌屬多樣性的PCR-DGGE指紋圖譜分析[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2010,31(4):475-480.

Analysis of intestinal bacterial diversity in abnormal sawda hilit people of colon cancer in traditional uyghur medicine*

Azierguli·Abudoukerimu1,Abudouhabaer·Abudoukerimu2,MaLanying3,Ailijiang·Maimaitiming4,SunYuping1,ChenFeng1,WangHongying1,Delixiati·Yimiti1△

(1.DepartmentofMicrobiology，XinjiangMedicalUniversity，Wulumuqi，Xinjang830011，China;2.BiologyDepartmentofScinceInistitute,HotanTeacher′sCollege,Hetian,Xinjiang848000,China;3.Gastroenterology，AffiliatedTumorHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Wulumuqi，Xinjang830011，China;4.DepartmentofInternalMedicine，XinjiangUygurMedicalCollege，Hetian，Xinjang848000，China)

Abstract:ObjectiveTo analyze the traditional uighur medicine abnormal sawda hilit people of colon cancer intestinal flora diversity by advanced molecular biology methods.MethodsChoice the colon cancer abnormal sawda hilit by uighur medicine and stool samples were collected from these groups and total genomic DNA was extracted.Extraction of total DNA designed a pair of universal primers to amplify the 16S rDNA V6 to V8 variable regions.Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) of the amplified sequences was performed then cloned the DGGE bands and sequencing.ResultsObtained by experiment reflect structural features of intestinal flora DNA fingerprinting，from sequence specific band sequencing out in the Genebank database on the blast program to compare，and make the evolutionary tree understanding of the relationship between intestinal microflora.ConclusionColon cancer abnormal sawda hilit intestinal microbial gene sequence showed bacteria have rarefaction state and Dominant bacteria are significantly lower.

Key words:uygur medicine；abnormal sawda hilit；colon cancer；intestinal microflora

(收稿日期：2015-10-24)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.04.003

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)04-0438-03

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30860385);新疆醫(yī)科大學(xué)創(chuàng)新基金項(xiàng)目(XJ201301)。

作者簡(jiǎn)介:阿孜爾古麗·阿布都克日木，女，講師，主要從事腸道菌群微生態(tài)研究。△通訊作者，E-mail:2316ymit@163.com。