甲殼類疾病及其防治技術（1）
——蝦類疾病（一）

○汪建國

（中國科學院水生生物研究所研究員博導）

甲殼類疾病及其防治技術（1）
——蝦類疾病（一）

○汪建國

（中國科學院水生生物研究所研究員博導）

（一）病毒性疾病

1.白斑綜合征俗稱白斑病，是對蝦的嚴重傳染性疫病，20世紀90年代以來一直嚴重威脅著全世界對蝦的養殖安全。該病的特點是感染率高、發病急、死亡率高、死亡速度快。病蝦活力弱，部分瀕死蝦頭胸甲部位出現白色斑點，白斑綜合征因此而得名，但亦可不出現白斑而蝦體變紅。2008年《中華人民共和國農業部公告》第1125號將其列為一類動物疫病，OIE將其列為必須申報的疾病。

【病原體】白斑綜合征病毒（Whitespot syndromevirus，WSSV）。

【流行與危害】20世紀90年代初，該病首先出現于日本及我國臺灣、廣東、福建等地，隨后擴散并遍及亞洲主要對蝦養殖國家和地區。幾年后蔓延到南北美洲，造成全球性的對蝦養殖業損失。一般蝦池發病后2～3天，最多不足1周時間可致全池死亡。

白斑綜合征病毒的宿主范圍非常廣泛。已知40多種對蝦和非對蝦甲殼動物可感染該病毒，其中中國明對蝦最為易感，其他可被感染致病或成為病毒攜帶者的對蝦科生物有：斑節對蝦、凡納濱對蝦、日本囊對蝦、墨吉對蝦、長毛對蝦、印度對蝦、桃紅對蝦、細角對蝦、白對蝦、褐對蝦、刀額新對蝦等。另外，羅氏沼蝦、海南沼蝦、埃氏沼蝦、藍氏沼蝦、脊尾白蝦、鼓蝦、克氏原螯蝦、哈氏美人蝦、龍蝦、蝦蛄、三疣梭子蟹、鋸緣青蟹、中華絨螯蟹、天津厚蟹、肉球近方蟹、日本大眼蟹、鱟等甲殼類動物等也可被感染。

在自然感染過程中，經口和鰓感染是傳播的主要途徑，對蝦在幼體期易經口和鰓感染從而使蝦苗攜帶病毒。此外，發病對蝦精巢、精莢、卵巢中都能檢測到病毒，因此受精卵可被污染從而造成垂直傳播。由于多種甲殼動物都可攜帶該病毒，自然環境中病毒極易在動物個體間進行傳播，使白斑病的防治工作變得較為困難。

【癥狀及病理變化】發病蝦厭食，空胃，行動遲緩，彈跳無力，靜臥不動或在水面兜圈。頭胸甲易剝離，殼與真皮分離，部分患病對蝦在頭胸和最后的尾節甲殼內側可見白色斑點；患病中國明對蝦、凡納濱對蝦、日本囊對蝦體色發紅，而患病斑節對蝦在瀕臨死亡時則顯示變藍現象。血淋巴混濁、不凝固，血淋巴細胞減少。甲殼上白斑的主要成分是碳酸鈣，是由于白斑綜合征病毒在上皮細胞內的迅速增殖導致鈣、磷比顯著增高，使甲殼上形成了碳酸鈣的沉積。

病毒侵害的主要組織和器官是甲殼下上皮組織、胃及后腸上皮組織、結締組織、觸角腺、造血組織、鰓、血淋巴器官。胃部壞死最嚴重，肝胰腺實質細胞、中腸上皮細胞、肌纖維細胞不被感染。

感染早期，被侵害組織的少量細胞核略微膨大，核中出現嗜酸性著色區域，核仁邊移；隨著感染時間延續，細胞核內嗜酸性著色很快轉變為大的嗜堿性包涵體，使細胞核顯著膨大，染色質只在細胞核邊沿隱約可見，大量細胞被侵染。

病毒粒子在細胞核中復制和裝配，成熟病毒粒子聚集于細胞核中，最后細胞解體，病毒粒子再感染周圍細胞。在肌纖維之間的結締組織及肝胰腺血竇的血細胞中也可見到病毒粒子。甲殼內面的白點在顯微鏡下可見呈重瓣的花朵狀，外圍較透明，花紋較清楚，中部不透明。

【診斷方法】在本病嚴重暴發流行時，可根據其發病史、臨床特征及病理特征作出初步診斷，最后確診需要通過實驗室檢查。診斷時應注意與桃拉綜合征、細菌性白斑病相區別。本病的實驗室診斷方法主要是通過采集急性病例的鰓、胃、附肢或其他上皮組織，進行下列檢查。

（1）樣品采集采集150尾蝦，按不同的大小或感染期取不同組織樣品。其中對蝦幼體、仔蝦取完整個體，幼蝦和成蝦取蝦的頭胸部，非對蝦的甲殼類動物參照對蝦的方法取樣。非生物樣品取0.1～0.5g。

樣品采集的要求參照SC/T7202.1-2007《斑節對蝦桿狀病毒診斷規程第1部分：壓片顯微鏡檢查法）》附錄B的規定或者按照OIE《水生動物疾病診斷手冊》中的列表要求采樣。

（2）組織及病理學檢查

①新鮮組織的快速染色法：取新鮮的蝦組織做成涂片，用“臺盼藍-伊紅”染色法（T-E染色法）染色后，檢查受感染細胞的典型變化。該方法適用于在現場或診斷實驗室對患病瀕死的對蝦仔蝦、幼蝦或成蝦進行快速診斷。

②組織病理學診斷：經HE染色后可清晰地觀察到各種不同組織結構的病理變化。HE染色適用于發病對蝦或其他敏感宿主的初步診斷和對懷疑染病宿主的診斷，不適于非感染性攜帶病毒樣品的病毒檢測。

③電鏡診斷：電鏡切片可在病蝦鰓、胃、淋巴器官、皮下組織等的細胞核內觀察到病毒粒子，通過提純負染，電鏡下可觀察到完整的病毒粒子或無囊膜的核衣殼從而進行確診。

（3）病原學鑒定

①生物診斷法：該法采用白斑綜合征病毒指示器-SPF凡納濱對蝦幼蝦進行試驗。將采集的可疑蝦附肢或蝦頭尖與TN緩沖液混合勻漿，離心上清液用2%無菌生理鹽水按1：10的比例稀釋，對指示蝦進行肌內注射（IM），然后進行臨床觀察和組織病理學診斷。

②核酸探針檢測法：采用白斑綜合征病毒特異性的非放射性的地高辛標記探針進行，敏感性高于傳統的病理組織學診斷法。核酸探針斑點雜交檢測法適用于對蝦的成蝦、幼蝦、仔蝦、幼體和受精卵的活體、冰鮮或冰凍產品和其他甲殼動物感染病毒的篩查、臨床病癥的確診。

③PCR檢測法：通過聚合酶鏈式反應，檢測病毒的特定基因。適用于對蝦各種樣品、環境生物和餌料生物的各種樣品以及其他非生物樣品中WSSV的定性檢測，具有高靈敏度和高特異性，適用于病原篩查和疾病確診。

④單克隆抗體檢測法：應用特異性的病毒單克隆抗體，采用斑點免疫印跡、免疫熒光和ELISA等方法進行診斷。

【防治方法】

（1）預防選擇健康蝦作為親蝦，培養健康蝦苗。受精卵用含氯漂粉精或碘伏（聚乙烯砒咯烷酮碘）浸洗或用過濾海水并經紫外線消毒后沖洗5分鐘。育苗用水應過濾和消毒，育苗期間切忌溫度過高和濫用藥物。

做好養殖池塘的清淤、消毒及培水工作。蝦池在養蝦前盡可能徹底清淤，然后進行消毒。用生石灰或含氯消毒劑均勻潑灑全池，消毒后應曝曬1周左右，然后進水。養殖過程中合理用水、培好水色、保持優良水質。在養蝦場附近有蝦病流行時，停止從海區向蓄水池注水，應將蝦池中的水與蓄水池中的水循環使用。養蝦池中適當混養一些攝食浮游生物或底棲藻類的魚或貝類，有利于防止水質過肥，起凈化水質的作用。

放養密度要合理。對蝦的放養密度應根據當地水源、海域環境、蝦池的結構和設備、生產技術、管理經驗、蝦苗的規格、飼料的質和量等條件而定。飼養管理過程中要注意水質及各種理化因子的變化，保持水體的相對穩定；堅持巡塘，定期檢查，正確診斷，積極預防。在養蝦池中接種和培養光合細菌凈化水質，投喂能提高對蝦細胞免疫力的中草藥和免疫促進劑，也是目前常用的防治途徑之一。

（2）控制對苗種場、良種場實施防疫條件審核、苗種生產許可管理制度。加強疫病監測與檢疫、掌握流行病學情況。可通過培育或引進抗病品種、切斷傳染源以及加強飼養管理等綜合措施控制本病。

（3）處理苗種繁殖場內WSSV檢疫呈陽性的親蝦和苗種應全部撲殺；病毒陽性的種用和商品養殖蝦必須進行無害化處理，禁止用于繁殖育苗、放流或直接作為水產餌料使用。

2.桃拉綜合征

俗稱“紅尾病”，是一種嚴重傳染性對蝦疾病，急性期以蝦體變紅（蝦紅素增多）、軟殼，過渡期以角質上皮不規則黑化為特征。2008年《中華人民共和國農業部公告》第1125號將其列為二類動物疫病。OIE將其列為必須申報的疾病。

【病原體】桃拉綜合征病毒（Taura syndromevirus，TSV）。

【流行與危害】該病主要侵害凡納濱對蝦和細角對蝦，對蝦科濱對蝦屬所有成員均對本病易感，中國明對蝦也對本病易感；凡納濱對蝦除卵、受精卵和蝦蚴外，仔蝦、幼蝦及成蝦等各期均對本病易感，主要感染14～40日齡、體重0.05～5g以下的仔蝦，部分稚蝦或成蝦也容易被感染。對蝦科其他屬成員經直接攻毒也可感染，但一般不表現癥狀。細角對蝦選擇系對TSV（基因1型或A抗原型）有抵抗力。

其他已報道TSV的自然感染或試驗感染宿主有白對蝦、南方對蝦、斑節對蝦、刀額新對蝦、中國明對蝦、日本囊對蝦、褐對蝦和桃紅對蝦。

目前，本病廣泛流行于美洲和東南亞對蝦養殖區。該病1992年首次發現于厄瓜多爾桃拉河地區，之后隨染疫仔蝦和親蝦貿易迅速傳播到厄瓜多爾、秘魯、哥倫比亞、洪都拉斯、危地馬拉、薩爾瓦多、巴西、尼加拉瓜、伯利茲、墨西哥、美國等美洲各大蝦類養殖區。1999年中國臺北從中南美洲進口凡納濱對蝦而傳人本病，此后，隨親蝦和仔蝦的貿易傳播到中國大陸、泰國、馬來西亞、印度尼西亞等地。

該病發病急，死亡率高。一般發病蝦池自發現病蝦至對蝦拒食人工飼料僅5～7天，10天左右大部分對蝦死亡。部分蝦池采取積極消毒措施后轉為慢性病，逐日死亡，至養成收獲時成活率一般不超過20%。本病主要通過健康蝦攝食病蝦、帶病毒水源等方式水平傳播；也可經海鷗等海鳥、劃蝽科類水生昆蟲攜帶病毒傳播。攜帶病毒親蝦也可能經垂直途徑傳播到后代，但目前尚無可靠證據。持續感染蝦和終生帶毒蝦是傳染源；染疫存活凡納濱對蝦和細角對蝦可終生帶毒成為疾病傳播者。

【癥狀及病理變化】

（1）癥狀根據病程和癥狀，桃拉綜合征可分為急性期、過渡（恢復）期和慢性期3個階段。

①急性期：蝦紅素增多，蝦體全身呈淡紅色，尾扇和游泳足呈鮮紅色，因此蝦民稱之為“紅尾病”。取尾扇發紅的病蝦，用10倍放大鏡仔細觀察細小附肢（如末端尾肢或腹肢）的表皮上皮，可以看到病灶處的上皮壞死。急性感染蝦常死于蛻皮期間，處于脫殼后期的病蝦以軟殼、空腹為特征，瀕死蝦常浮于水面或池體邊緣。

②過渡（恢復）期：介于急性期與慢性期之間，病程極短，以病蝦角質層上皮多處出現不規則黑色斑點為特征。在過渡期，典型的急性期表皮損傷在數量和嚴重程度上都有所減少或降低，病灶壞死處聚集了大量血細胞及其滲出物。大量血細胞隨后開始黑化，進而導致病蝦角質層上皮呈現不規則的黑色斑點。

③慢性期：成功蛻皮的病蝦，從過渡期轉入慢性期，一般無明顯的臨床癥狀，但對正常的環境應激（如突然降低鹽度）明顯不如未染疫蝦。有的因病毒在淋巴器官持續感染而成為終生帶毒者。

（2）病理特征

①急性期：全身角質層上皮、附肢、鰓、后腸、前腸（食管、前后胃室）可見多灶性壞死；有時在角質層皮下結締組織細胞，以及靠近感染角質層上皮的條紋肌纖維基質也可見感染灶。嚴重的病例，觸角腺管狀上皮也遭破壞。多灶性表皮壞死的典型癥狀包括多個感染細胞聚集在一起、細胞質嗜酸性增加、細胞核固縮或崩解。

②過渡（恢復）期：該期病理特征是桃拉綜合征過渡期的典型特征。在HE染色的組織病理切片上，這樣的病灶表現為角質層被侵蝕，暴露的表皮血細胞和上皮被大量弧菌感染和侵襲。在桃拉綜合征過渡期，對蝦淋巴器官的組織切片在HE染色后觀察，可能外觀正常。但如果應用TSV特異性的cDNA探針對這些切片進行免疫組織化學染色（ISH），就可以觀察到大量的病毒聚集在淋巴小管的外周實質細胞內。

③慢性期：該期病蝦的組織病理變化不明顯，僅可見大量的“類淋巴器官球體”（LOS）。類淋巴器官球體可能與成對淋巴器官的主體相連，或脫離形成異位的類淋巴器官體，位于血腔的局部區域（如心、鰓或皮下結締組織中等）。類淋巴器官球體由淋巴器官細胞和血淋巴細胞呈球形堆積而成，但從其球形特征以及缺乏中心管（典型的淋巴器官小管），可與正常淋巴器官進行區別。應用TSV特異性的cDNA探針進行免疫組織化學染色，這些“類淋巴器官球體”的部分細胞會呈現陽性反應，而其他靶組織細胞呈陰性反應。

【診斷方法】

（1）初步診斷僅急性期的病蝦表現出行為的改變。急性期病蝦呈現缺氧狀態，常聚集在池塘邊緣或水面等溶氧高的地方，從而吸引大量的海鳥捕食。因此由垂死對蝦吸引來的海鳥在蝦池上空大量聚集，常可代表蝦池內暴發了嚴重的流行病（通常是桃拉綜合征或白斑綜合征）。通常可以依據流行病學、臨床特征和病理特征對急性期桃拉綜合征做出初步診斷：病蝦蝦體全身淡紅色、尾扇和游泳足鮮紅色，游泳足或尾足邊緣處上皮呈灶性壞死，常死于蛻皮期間，表現為軟殼、空腹等特征。

（2）樣品采集采集病蝦10尾，健康蝦150尾，按不同的大小或感染期取不同組織樣品。其中，對蝦幼體、仔蝦取完整個體，幼蝦和成蝦取蝦的頭胸部，非對蝦的甲殼類動物參照對蝦的方法取樣。非生物樣品取0.1～0.5g。

樣品采集的要求參照SC、T7202.1-2007《斑節對蝦桿狀病毒診斷規程第1部分：壓片顯微鏡檢查法）》附錄B的規定或者按照OIE《水生動物疾病診斷手冊》中的列表要求采樣。

（3）組織和病理學檢查依據前述病蝦的組織病理特征對該病作出診斷。該方法適用于桃拉綜合征的急性期、過渡期和慢性期患病對蝦的確診和對桃拉綜合征的篩查，不適用于對潛伏性感染或非感染性攜帶病毒標本進行疾病診斷。過渡期病蝦角質層上皮多處出現不規則黑化斑，血細胞聚集，軟殼及蝦紅素不明顯。慢性期一般無明顯臨床癥狀。

（4）實驗室診斷和病原學鑒定

①生物診斷法：采用SPF凡納濱對蝦幼蝦作為桃拉綜合征病毒指示器，對疑似感染蝦進行生物檢測，具體方法有口服法和注射法。口服法：該法比較容易操作，可用較小的SPF凡納濱對蝦幼蝦進行試驗。指示蝦隨機分為兩組，其中感染組以剁碎的疑似感染蝦樣品飼喂，對照組以正常飼料飼喂，然后對兩組蝦進行臨床觀察和大體病理、組織病理學診斷。注射法：將采集的可疑蝦頭或全蝦樣品與TN緩沖液或2%的無菌生理鹽水按1：2或1：3混合勻漿，離心取上清作為接種物，對指示蝦進行肌內注射，然后進行臨床觀察和外觀癥狀、組織病理學診斷。注射接種法宜采用較大的指示蝦進行。

②免疫檢測技術：

斑點酶免疫反應（DBI）：該法以感染蝦或SPF蝦血淋巴制取純化病毒，作為檢測抗原，點加于MA-HA-N45反應板表面，干燥后，以磷酸鹽緩沖液和含山羊血清與酪蛋白的吐溫20進行阻斷。用單抗TSVMAb1A1進行斑點酶免疫反應。

其他抗體檢測方法：包括利用TSV MAb1A1單克隆抗體的間接熒光抗體法（IFAT）和免疫組化法（IHC）等。這些方法適用于組織印片、冰凍切片和脫蠟的固定組織樣品及Davidson'sAFA固定的組織樣品中的病毒檢測。

③分子檢測技術：目前已開發有原位雜交實驗（ISH）、逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）和實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（real-timequantitativeRT-PCR）等方法。原位雜交實驗是采用非放射性的以地高辛標記的eDNA探針進行，敏感性高于傳統的病理組織學診斷方法。逆轉錄聚合酶鏈反應法適用于對蝦的各生活期、非對蝦的生物和底泥等樣品中TSV帶毒情況的定性檢測，以進行病原篩查和疾病的確診，但該法單獨使用時不適用于對病毒量、存在狀態（玷污、攜帶和感染狀態）或感染活性等的估測以及宿主感染程度的評估。實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應法具快速、特異和敏感優點，對TSV基因組目標序列檢測靈敏度大約為100個拷貝。

【防治方法】

（1）預防進行水體消毒，每10～15天（特別是在進水、換水后）應及時用漂白粉等含氯消毒劑消毒。調控水質，保持整蝦池水質平衡及穩定。蝦池pH一般維持在8.0～8.8，氨氮0.5mg/L以下，透明度維持在30～60cm。在養殖過程中，定期使用水質及底質改良劑，改良養殖池底質。特別是在養殖中后期，應用光合細菌、硝化細菌等微生態制劑的改良劑進行水質和底質改良。配合使用維生素、聚維酮碘等進行預防。也可以在飼料中添加生物活性物質或免疫促進劑，增強蝦體非特異性免疫功能。

（2）控制可通過培育或引進抗病品種、切斷傳染源以及加強飼養管理等綜合措施控制本病的暴發。對苗種場、良種場應實施防疫條件審核、苗種生產許可管理制度；加強疫病監測與檢疫，掌握其流行情況。

（3）處理TSV檢疫陽性結果的親蝦和商品養殖蝦必須進行無害化處理，禁止用于繁殖育苗、放流或直接作為水產餌料使用。

（未完待續）

（通聯：430072，中國科學院水生生物研究所武漢市武昌東湖南路7號）