乙型肝炎病毒X區基因變異與原發性肝癌的關系研究

楊偉 李增彩 倪秀瑩 王濤

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乙型肝炎病毒X區基因變異與原發性肝癌的關系研究

楊偉 李增彩 倪秀瑩 王濤

【摘要】目的 初步研究乙型肝炎病毒（HBV）X區基因變異與原發性肝癌的關系。方法 收集39例HBV感染患者的肝（癌）石蠟組織標本，其中慢性乙型肝炎（CHB）14例、肝細胞癌（HCC）25例。采用聚合酶鏈式反應（PCR）方法擴增組織中HBVX區基因，并對PCR產物進行DNA測序，分析常見變異位點的變異情況。結果 1. HCC組與CHB組相比，在X區發生插入/缺失變異，聯合變異的位點及例數增多，并且A1762 T與G1764 A常發生雙突變。2. HBVX區變異頻率較高位點依次是C1655 T/G、A1605 C/G、A1762 T、G1764 A、A1772B、A1645 C、C1687 A、G1776 T。結論 HBVX區存在點突變、插入/缺失變異及聯合變異，可能在HCC的發生和發展過程中起重要作用。

【關鍵詞】原發性肝癌；HBVX基因；變異

肝細胞癌（HCC）是最常見的惡性腫瘤之一，乙型肝炎病毒（HBV）的慢性感染是其最重要因素。研究資料證明HBVX區病毒變異與HCC發生和發展有關。本研究對慢性HBV感染者，其中慢性乙型肝炎（CHB）14例、HCC25例，共39例石蠟組織標本的HBVX區基因變異情況進行檢測，以初步探討HBVX區基因變異與HCC的關系。

資料和方法

一、標本來源及分組

收集39例慢性HBV感染者肝（癌）組織標本，其中CHB組肝組織14例、HCC組肝癌組織25例。

二、主要儀器和試劑

PCR擴增儀：雙螺旋牌PTC-51 DNA溫度循環器（軍事醫學科學院放射醫學所總后勤部衛生部監制），PCR擴增試劑盒購自上海生工生物工程技術有限公司，DL2000 DNAMarker購自日本Ta KaRa公司。

三、石蠟組織中HBVDNA提取

采用傳統的酚-氯仿提取法，提取后置-20℃冰箱保存。除了石蠟組織樣品外，每次提取過程都以1份雙蒸水樣品，作為全程的污染監控。所有離心過程都在室溫下進行。

四、引物的設計合成及PCR反應體系

從Pub Med GenBank上下載兩條我國常見的B和C基因型的基因序列（ayr基因型，序列號為X04615和NC-003977），通過查閱文獻資料和應用VectorNTISuite8.0軟件對基因序列多態性進行分析，找出X區保守區序列，利用Primer 5.0軟件設計出針對HBVX基因序列特異的引物，并在blast上比對，最終篩選出如下引物序列。上游引物：5＇-TGTGCACTTCGCTTCACCTCT-3＇，下游引物：5＇-AGACCAATTTATGCCTACAGC-3＇，并委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成。目的基因位于nt1578-1800，PCR擴增產物大小為223 bp。PCR反應體系：在50μL反應體系中，加入2×PCRMaster緩沖液25μL（內含10 MMTris -HCl、PH8.4的50 MMKCl、1.6 MMMgCl2）、上游引物1.0μL、下游引物1.0μL、模板1.0μL。反應條件：95℃預變性5 min，在94℃變性60 s、51℃退火60 s、72℃延伸60 s，進行35個循環，72℃終延伸10 min。最后在-20℃冰箱保存。

五、產物測序及序列分析

PCR擴增產物純化后直接測序，為保證測序結果的可靠性，測序采用正反雙向測序。測序結果應用BioEdit7.0、Clustal W軟件與標準序列進行比較，同時在http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上進行比對，測序工作由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

六、統計學方法

采用χ2檢驗。

結　果

一、X區基因擴增情況

PCR擴增產物經2.0％瓊脂糖凝膠電泳觀察（圖1），結果顯示HCC組20例（20/25）與CHB組5例（5/14），共25例擴增出與設計的目的基因長度一致的特異性片段，兩組目的基因擴增陽性率差異無統計學意義（P＞0.05）。

二、HCC組和CHB組HBVX區基因點突變情況（見表1）。

表1　25例標本HBVX區基因變異情況

對擴增25例標本進行測序，共發現71個位點發生點突變，前8位變異最多的位點及突變例數依次為：C1655 T/G（25例）、A1605 C/G（20例）、A1762 T（18例）、G1764 A（14例）、A1772B（12例）、A1645 C（10例）、C1687 A（10例）、G1776 T（10例）。25例均存在C1655 T/G變異，20例合并A1605 C/G變異，18例合并BCP區熱點雙突變A1762 T/G1764 A。HCC組在突變位點和例數方面均較CHB組多，且常發生A1762 T與G1764 A雙突變。

三、HCC組和CHB組HBVX區基因插入/缺失變異的情況

HCC組發現有18例（18/25）存在插入/缺失變異情況，分別為nt1641-1644缺失1個C、nt1633-1636間缺失GG、nt1647-1648間插入1個A、nt1676-1677間插入1個T、nt1678-1681間缺失AA、nt1731-1735間缺失1個C、nt1739-1742間缺失1個A；CHB組僅有2例（2/14）發現缺失變異，分別為nt1680缺失A、nt1622-1625缺失1個A。HCC組發生插入/缺失變異的例數及變異位點明顯多于CHB組。

四、HCC組和CHB組聯合變異的情況

聯合變異存在從四聯到十聯不同程度的變化情況（見表2）。

表2　常見變異位點在12例標本中聯合變異的情況

討　論

肝癌是最常見惡性腫瘤之一，HBV病毒的慢性感染是肝癌的最重要因素。研究資料證明HBVX區病毒基因變異與HCC發生和發展有關，但各項研究尚無統一的觀點和結果。我們所擴增的基因序列位于HBVX區的nt1587-1800區段，該區段包含多個HBVDNA復制的關鍵調節元件：BCP（ntl742-1849）、CURS（nt1643-1742）、NRE（ntl457-1628）和EnhⅡ（ntl627-1774）［1］。

在成功測序的25例標本（HCC組20例、CHB組5例）中，均存在C1655 T/G變異，另外有20例發生A1605 C/G變異，推測這兩個位點變異可能在HBV感染的早期便會發生，而與HCC的發生和發展無密切關系。變異例數前8位位點依次為：C1655 T/G、A1605 C/G、A1762 T、G1764 A、A1772B、A1645 C、C1687 A、G1776 T。BCP區基因變異A1762 T、G1764 A通常以雙突變的形式存在，是目前的研究熱點。大量研究證明，該雙突變不僅與肝臟炎癥壞死和纖維化有關，還與HCC密切相關。一些學者發現A1762 T/G1764 A雙突變在HCC組與非HCC組有明顯差異［2，3］；也有學者持不同意見，認為BCP區雙突變在HBV慢性感染者中與肝纖維化的進展有關，而不是與HCC有關，我們的研究較支持后一觀點。

既往研究發現nt1772鄰邊位點常發生插入/缺失變異［4，5］。本研究25例HCC組發現有9例存在插入/缺失變異情況，而14例CHB組僅有3例發現缺失變異。大量的研究資料顯示缺失變異常發生于羧基端如nt1763-1770、ntl770-1777、ntl753-1772、nt1750-1770等部位的缺失，這些突變能夠降低HBV的復制水平，與HBs Ag陽性、HBeAg陰性的無癥狀攜帶現象密切相關［6］。X區的插入/缺失變異可能與疾病的進展有關，Seoung-Ae Lee等發現缺失/插入變異在肝硬化、HCC比CHB、乙型肝炎病毒攜帶者明顯增高，且均伴隨BCP雙突變［7］。X區發生插入/缺失變異后將產生移碼變異，使HBs Ag發生改變，喪失對細胞增殖抑制作用，導致肝細胞過度增生發生癌變。

HBVX區基因不但可以在自己區域內發生聯合變異，還可以與其他開放讀碼框內的位點發生聯合變異，本研究中表2也證實了這點。25例標本中的熱點變異位點存在從四聯到十聯不同程度的聯合變異，HCC組在突變例數及聯合變異的位點數目方面均較CHB組多，在所有發生聯合變異的標本中有7例合并BCP區熱點雙突變A1762 T/G1764 A。一項Meta分析顯示BCP區雙突變在HCC患者較非HCC患者明顯增高，若聯合EnhII/BCP其他變異位點如C1653 T、T1753 V，則這種差異更加顯著，而且是肝癌發生的早期事件；而C1653 T、T1753 V可能是肝癌發生的晚期事件［8］。HBV相關性肝癌的發生和發展是一個極其復雜的過程，既往研究比較局限于單一位點變異的作用，近年來大家更注重多基因位點、多區域片段聯合變異所造成的影響，這也許能更全面地研究和發現HBV基因變異在HCC中的作用。

參 考 文 獻

1 朱榮.慢性乙型肝炎組織病理學指標及病毒X基因變異與患者預后的相關性研究.上海：復旦大學，2006.

2 Shi M，Zhang Y，Zhang J，et al. Hepatitis Bvirus genotypes，precore Mutations and basal core pro Moter Mutations in HBV-infected Chinese patients with persistently normal alanire a minotransferase and low seru MHBVDNAlevels. Braz JInfect Dis，2012，16：52-56.

3 Asim M，Malik A，Sarma MP，et al. Hepatitis Bvirus BCP，Precore/ core，Xgene Mutations/genotypes and the risk of hepatocellular carcino ma in India.JMed Virol，2010，82：1115-1125.

4 Moriyama K. Reduced antigen production by hepatitis Bvirus harbouring nucleotide deletions in the overlapping Xgene and precore-core pro Moter.JGen Virol，1997，78：1479-1486.

5 Cui XJ，Cho YK，Song HJ，et al. Molecular characteristics and functional analysis of full-length hepatitis Bvirus quasispecies fro Ma patient with chronic hepatitis Bvirus infection.Virus Res，2010，150：43-48.

6 謝佳新，殷建華，何永超，等.乙型肝炎病毒基因變異及其臨床意義.中華疾病控制雜志，2009，13：358-361.

7 Lee SA，Mun HS，Kim H，et al. Naturally occurring hepatitis Bvirus Xdeletions and insertions a Mong Korean chronic patients.JMed Virol，2011，83：65-70.

8 Liu S，Zhang H，Gu C，et al. Associations between hepatitis Bvirus Mutations and the risk of hepatocellular carcino ma：a meta-analysis. JNatl Cancer Inst，2009，101：1066-1082.

（本文編輯：易玲）

收稿日期：（2015-05-13）

作者單位：261021 山東省濰坊市第八九醫院傳染科