pEGFP-prohibitin真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在人肝癌細(xì)胞系Hep G2中的表達(dá)

翟嵩 孫明珠 王文俊 李亞萍 張欣 李梅黨 雙鎖

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pEGFP-prohibitin真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在人肝癌細(xì)胞系Hep G2中的表達(dá)

翟嵩 孫明珠 王文俊 李亞萍 張欣 李梅黨 雙鎖

【摘要】目的 構(gòu)建pEGFP-prohibitin真核表達(dá)質(zhì)粒，并鑒定其在pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞系Hep G2中的表達(dá)。方法 采用高保真PCR擴(kuò)增獲得prohibitin的全長(zhǎng)編碼序列，構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-prohibitin，并通過(guò)基因測(cè)序和BLAST比對(duì)鑒定重組質(zhì)粒；提取pEGFP-prohibitin和pEGFP-N1質(zhì)粒，并通過(guò)TurboFect轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞；采用實(shí)時(shí)PCR和Western印跡方法分別在MRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)prohibitin蛋白在轉(zhuǎn)染后Hep G2細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果 成功構(gòu)建pEGFP-prohibitin真核表達(dá)重組質(zhì)粒，并將其成功轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞；pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染組細(xì)胞prohibitin的表達(dá)量比空載轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞明顯增加。結(jié)論 成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-prohibitin，并證明抗增殖蛋白prohibitin在pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系Hep G2中高表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】prohibitin蛋白；基因表達(dá)；重組質(zhì)粒；轉(zhuǎn)染

抗增殖蛋白prohibitin屬于細(xì)胞膜蛋白超家族，是一種正常人體細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的多功能蛋白［1］，在物種間高度保守［2］。prohibitin為線粒體分子伴侶蛋白，有利于維持線粒體的形態(tài)和功能，異常表達(dá)可引起線粒體損傷，從而可能啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)源性凋亡［3］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，prohibitin與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，尤其是在肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用［4］。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，prohibitin在 HCB體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)表達(dá)上調(diào)［5］。通過(guò)對(duì)其功能的研究將有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)肝臟疾病的發(fā)生機(jī)制，從而為臨床治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。但到目前為止，prohibitin高表達(dá)對(duì)于HCV所導(dǎo)致的肝細(xì)胞……