強精煎對奧硝唑所致少弱精子癥大鼠抗氧化作用實驗研究*

賓 彬，陸海旺，王 杰，王德勝，徐杰新，覃智標，梁勁松，龐秋華，崔錦珠

(廣西中醫藥大學第一附屬醫院，南寧 530023)

強精煎對奧硝唑所致少弱精子癥大鼠抗氧化作用實驗研究*

賓 彬，陸海旺△，王 杰，王德勝，徐杰新，覃智標，梁勁松，龐秋華，崔錦珠

(廣西中醫藥大學第一附屬醫院，南寧 530023)

目的:觀察強精煎對奧硝唑(ORN)誘導的少弱精子癥大鼠附睪精子氧化應激的保護作用。方法:60只大鼠按隨機數字表法分為4組，模型組給予ORN，黃精贊育膠囊組給予ORN+黃精贊育膠囊，強精煎組給予ORN+強精煎，空白組給予生理鹽水。測定大鼠附睪精子的濃度、活動率、附睪丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮合酶(NOS)活力以及睪丸附睪超微病理。結果:與空白組比較，模型組精子濃度及活動率、附睪SOD、GSH-Px活力明顯降低，MDA濃度及NOS活力顯著升高;與模型組比較，強精煎組及黃精贊育膠囊組精子濃度及活動率、SOD及GSH-Px活力升高，MDA、NOS活力降低。模型組生精上皮破損顯著、紊亂，精子產量銳減，強精煎組及黃精贊育膠囊組生精上皮受損輕、生精產量接近空白組。結論:強精煎可增強抗氧化酶活性，抑制氧化應激對生精功能和精子活力的不良影響。

抗氧化作用;ROS;少、弱精子癥;健脾益腎法;強精煎

活性氧在精子運動及其獲能中起重要作用，適量的活性氧可保護精子活力，反之過高的活性氧則造成精子膜的損傷，抑制精子活力，導致精子總活力下降，進而影響精-卵結合，還可損傷精子 DNA，而精子 DNA的改變可以使有缺陷的 DNA傳給胎兒［1］。研究表明，活性氧在精子的DNA損傷中扮演重要角色［2］。因此，抗氧化藥物在男性不育治療中的應用在國內外均得到重視［3-4］。本研究通過誘導少弱精子癥大鼠，觀察強精煎對少弱精子癥大鼠附睪精子的抗氧化作用及其對睪丸、附睪上皮病理損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

MACRO精子計數板和CFT-9201X型CASA精子分析系統(江蘇瑞琪有限公司生產);752型 紫外-可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司); HR801型酶標儀(深圳華科瑞科技有限公司);掃描電子顯微鏡，廣西醫科大學電鏡室提供分析服務。

考馬斯亮藍蛋白、NOS、SOD、MDA、GSH-Px等試劑盒，來自南京建成生物工程研究所。

1.2 藥物

強精煎組成:菟絲子、枸杞各 20 g，當歸、紫河車、神曲各10 g，黃芪、益母草各30 g，黨參、續斷、鹿角霜各15 g［5］，采用單味免煎中藥(江陰天江藥業有限公司生產);黃精贊育膠囊(由黃精、肉蓯蓉、淫羊藿、紫河車、黨參、當歸、蛇床子、水蛭、牡蠣等組成)，上海新亞藥業邗江有限公司生產;奧硝唑膠囊，購自四川百利藥業有限公司。

1.3 動物來源、分組及給藥方案

8～10周齡的60只SD雄性性成熟大鼠，體質量(280±10)g，采購于廣西醫科大學實驗動物中心。按隨機數字表法分成4組，分組及給藥方法參照本課題組前期實驗方法，ORN用量加倍。模型組給予 ORN800 mg/kg，黃精贊育膠囊組給予 ORN (800 mg/kg)+黃精贊育膠囊(400 mg/kg)，強精煎組給予ORN(800 mg/kg)+強精煎(10 g/kg)，空白組給予生理鹽水，試驗藥物混懸液使用生理鹽水配制［5］。各組溶液灌胃體積均為4 mL，每日1次，連續28 d，具體給藥劑量根據大鼠每7 d 1次的體質量變化進行適時調整。

1.4 大鼠附睪精子濃度及活力測定

最后1次灌胃24 h后，以10%濃度的Urethane腹腔注射法麻醉大鼠，剪開腹腔，仔細完整地分離一側附睪尾，迅速置于盛有2 mL 37℃的生理鹽水平皿中剪碎，混勻并溫浴片刻(30 s左右)［5］，待精子充分擴散后，使用精子計數板和CASA檢測精子數量，并計算精子活力。

1.5 SOD、MDA、GSH-Px、NOS活力的測定

根據考馬斯亮藍蛋白試劑盒所示方法，取單側附睪尾用4℃生理鹽水在冰水浴中制成10%的附睪組織勻漿，轉速3000 r/min離心10 min，收集上清液分批凍存，比色法測定附睪組織蛋白的含量。最后根據試劑盒步驟測定SOD、MDA、NOS、GSH-Px活性。

1.6 超微病理分析

以電鏡專用的2.5%戊二醛固定各組大鼠睪丸和附睪尾，4℃冰箱保存過夜、切片。電鏡超微掃描觀察生精上皮、精子數量等情況。

1.7 統計學方法

采用PEMS3.1統計軟件進行分析，計量資料均符合正態分布，以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析多重比較，方差齊以 LSD-t檢驗，方差不齊用Dunnett’s T3檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 附睪精子濃度及活力

表1顯示，模型組精子濃度、活動率呈現明顯下降，與空白組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。強精煎組與黃精贊育膠囊組精子濃度、活動率接近，優于模型組(P＜0.05)，與空白組仍有差異(P＜0.05)。這表明800 mg/kg劑量ORN不但嚴重損傷了精子活力，也嚴重損害睪丸的生精功能，導致精子生成數量顯著減少。強精煎及黃精贊育膠囊干預后的大鼠附睪精子數量、活力盡管低于空白組，但仍顯著高于模型組。由此可見，強精煎能修復ORN氧化應激誘導的生精損傷，保護生精功能，提高精子活力。

表1 強精煎對大鼠精子濃度、活力的影響(±s)

表1 強精煎對大鼠精子濃度、活力的影響(±s)

注:與模型組比較:△P＜0.05;與空白組比較:*P＜0.05

組別 鼠數 精子濃度(×106/ml) 活動率(%) 15 54.67±6.31 71.03±6.23模 型 組 15 10.60±2.64* 10.65±1.27*黃精贊育膠囊組 15 36.93±4.02 49.42±4.66強 精 煎 組 15 37.47±2.97＊△ 50.31±5.90空白組＊△

2.2 附睪勻漿MDA、SOD、GSH-Px、NOS活力

表2顯示，與其余各組比較，模型組大鼠附睪NOS活力、丙二醛濃度升高(P＜0.05)。黃精贊育膠囊組、強精煎組丙二醛濃度接近，與模型組、空白組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。模型組超氧化物歧化酶、GSH-Px活力明顯下降，顯著低于空白組(P＜0.05)。黃精贊育膠囊組、強精煎組超氧化物歧化酶、GSH-Px活力均顯著優于模型組(P＜0.05)，但仍不及空白組(P＜0.05)，說明強精煎增強了大鼠附睪內抗氧化酶的活性，清除活性氧，抑制過度的氧化應激，與本課題前期研究結論一致［5］。

表2 強精煎對大鼠附睪MDA、SOD、GSH-Px、NOS活力的影響(±s)

表2 強精煎對大鼠附睪MDA、SOD、GSH-Px、NOS活力的影響(±s)

注:與模型組比較:△P＜0.05;與空白組比較:*P＜0.05

組別 鼠數 MDA(nmol·mg－1) SOD(NU·g－1) GSH-Px(NU·g－1) NOS(U/ml)空 白 組 15 6.24±1.27 109.60±13.55 34.64±5.80 1.58±0.61模 型 組 15 21.20±4.17* 47.86± 6.67* 12.03±1.68* 10.92±1.54*黃 精 贊 育 膠 囊 組 15 10.30±1.65△＊ 77.66± 5.96△＊ 20.12±2.76△ 1.82±1.55△強 精 煎 組 15 9.77±1.70△＊ 76.08± 9.32△＊ 20.16±2.47△＊ 1.69±0.52△

2.3 睪丸附睪超微病理

在強精煎組、黃精贊育膠囊組，生精上皮排列緊密，附睪上皮較為完整，生精活躍，與空白組尚存在一定差距(圖1、3、4);而模型組生精小管間隙增寬分離、空虛，生精上皮受損嚴重，層次大部分缺失，精子數量顯著少于其余各組(圖2)，比既往研究顯示出更為顯著的病理損傷［5］。

3 討論

ORN是常用的第三代硝基咪唑類藥物的衍生物。有學者研究發現，大劑量奧硝唑對雄性生育力有較強的毒性作用，當劑量達到800 mg/(kg·d)時，可導致大鼠睪丸質量顯著減輕，精子細胞明顯減少，生精細胞大片脫落，精子日產量也顯著減少［6］。因此本實驗使用該藥持續灌胃誘導出少弱精子癥大鼠模型。

ROS主要包括過氧化氫、O2－、OH－、一氧化氮等自由基，可危及細胞功能及存活。活性氧必須不停地被滅活，睪丸附睪中僅需保持一定的濃度且可受控制的活性氧以維持精子的生理功能。在生殖系統中，抗氧化系統主要由超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化酶以及其他血紅素蛋白過氧化物酶等構成［5］。其中，超氧化物歧化酶能清除O2－尤為重要，能抵抗 ROS對精子產生的毒性，從而維持機體氧化-抗氧化系統平衡，SOD還與精子數量呈正相關［7］。谷胱甘肽過氧化酶主要是清除過氧化氫，保護細胞膜結構和功能，若酶保護系統中某部分被削弱，該系統則會失效并引發永久的細胞損傷［5-8］。

圖1 空白組

圖2 模型組

圖3 黃精贊育膠囊組

圖4 強精煎組

精子質膜中有多聚不飽和脂肪酸(PUFA)大量存在，其對過量ROS引起的損傷極其敏感，而存在于精子胞質內的ROS清除酶數量有限，其補充來源于精漿，從而維持自身的抗氧化系統。精子質膜的流動性較為脆弱，能被生殖道內過量的活性氧所破壞，導致精子發生障礙，并對精子產生毒副作用。過高的活性氧引起精子膜發生脂質過氧化反應，繼而產生脂質過氧化及其降解產物，如丙二醛可使精子外觀結構、功能及代謝異常，從而導致男性生育力受損［9-11］。過高的活性氧破壞精子DNA完整性，引起精子形態異常，并形成惡性循環［11］。丙二醛是氧化應激反應程度的標志物，是衡量體內自由基產生程度的可靠指標［5］。而一氧化氮合酶活性增強誘導NO生成增多，過量的NO可引起精子結構改變，損傷精子活動能力。

筆者前期臨床研究表明，強精煎可顯著改善少弱精子癥患者的精子數量和活力，且有良好的安全性［13］。本研究中，強精煎組超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活力明顯優于奧硝唑模型組，而一氧化氮合成酶活力、丙二醛濃度顯著低于模型組;生精上皮較為完整，精子數量與活力均優于奧硝唑模型組，可見強精煎中藥可增強生殖系統的抗氧化酶活性，拮抗氧化損傷，維持精子發生，提高精子活力。方中菟絲子、枸杞為子類藥物填補腎精，黨參、黃芪補氣健脾，當歸補血活血，牡蠣固精澀精，益母草活血清熱利濕，全方具有健脾補腎、清熱利濕兼活血之功。藥理實驗表明，枸杞的有效成分枸杞多糖(LBP)能提高大鼠超氧化物歧化酶活性［14］，LBP還可抑制過氧化氫誘導的睪丸生精細胞病理損傷［15-16］;菟絲子有效成分能增強精子懸液中超氧化物歧化酶活力，降低丙二醛濃度［17］;黨參多糖可顯著降低大鼠Leydig細胞的丙二醛含量，增強谷胱甘肽過氧化物酶的活力［18］;五味子的活性成分既能增強抗氧化酶活性，又可清除氧自由基;紫河車多種酶有較強的抗氧化作用;黃芪原液體外添加于人類精子可提高其活力和活動率［19］;鹿茸、當歸、續斷的有效成分也具有抗氧化應激作用［20-21］。

綜上所述，強精煎能降低附睪丙二醛、一氧化氮合成酶含量，提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等活力，使得生殖系統免受氧化應激損傷，維持抗氧化酶系統，修復睪丸及附睪病理損傷，促進精子發生，為中醫藥抗氧化治療少弱精子癥提供了新的方法。其不足之處在于對ORN的睪丸毒性研究尚未涉及，對中藥強精煎修復生精上皮、提高精子活力的相關分子生物學機制也有待進一步的研究。

［1］ 戴繼燦.男性不育的輔助生殖技術處理:潛在風險與思考［J］.中華男科學雜志，2011，5:387-390.

［2］ F.Khosravi，M.R.Valojerdi，M.Amanlou，L.Karimian，F.Abolhassani.Relationship of seminal reactive nitrogen and oxygen species and total antioxidant capacity with sperm DNA fragmentation in infertile couples with normal and abnormal sperm parameters［J］.Andrologia，2014，46(1):17-23.

［3］ Golbidi S，Laher I.Antioxidant therapy in human endocrinedisorders［J］.Medical Science Monitor:International Medical Journal of Experimental and Clinical Research，2010，16(1): RA9-24.

［4］ 王亞軒，楊書文，瞿長寶，等.左旋肉堿治療弱精子癥患者的療效觀察［J］.中華男科學雜志，2010，16(5):420-422.

［5］ 賓彬，陸海旺，王德勝，等.強精煎對實驗大鼠附睪精子抗氧化作用的研究［J］.時珍國醫國藥，2013，24(5):1056-1058.

［6］ 熊芬，李高，龐雪冰，等.奧硝唑對雄性大鼠生育功能的影響［J］.生殖與避孕，2006，26(2):81-85.

［7］ Murarka Shivaa，Anil K.Gautama，Yogendra Vermaa，et al.Association between sperm quality，oxidative stress，and seminal antioxidant activity［J］.Clinical Biochemistry，2011，44(4): 319-324.

［8］ 黃宇烽，潘連軍，黃衛東.男科醫師手冊［M］.北京:人民衛生出版社，2009:104.

［9］ Michno Anna， Raszeja-Specht Anna， Jankowska-Kulawy Agnieszka，et al.Effect of L-carnitine on acetyl-CoA content and activity of blood platelets in healthy and diabetic persons［J］.Clinical chemistry，2005，51(9):1673-1682.

［10］ 李錚，陳國武，商學軍，等.左旋肉堿和乙酰左旋肉堿合用治療少弱精子癥有效性與安全性的多中心隨機對照臨床研究［J］.中華男科學雜志，2005，11(10):761-764.

［11］ 陳俊清，羅勝萍，黃誠剛.精漿活性氧水平與男性不育的相關性研究［J］.國際檢驗醫學雜志，2011，32(9):1002-1004.

［12］ Hauser R，Meeker JD，Singh NP，et al.DNA damage in human sperm is related to urinary levels of phthalate monoester and oxidative metabolites［J］.Human reproduction (Oxford，England)，2007，22(3):688-695.

［13］ 賓彬，王杰，陳定雄，等.強精煎治療少弱精子癥臨床療效及安全性研究［J］.西部中醫藥，2012，25(4):5-7.

［14］ 黃曉蘭，楊明亮，吳曉旻，等.枸杞多糖對大鼠生殖系統保護作用的機制探討［J］.武漢大學學報:醫學版，2004，25(1): 29-31.

［15］ 黃曉蘭，閆俊，吳曉旻，等.枸杞多糖對H2O2誘導的小鼠生殖細胞損傷的影響［J］.食品科學，2003，24(12):116-118.

［16］ 黃曉蘭，楊明亮，吳曉旻，等.枸杞多糖對小鼠睪丸細胞DNA損傷的保護作用［J］.衛生研究，2003，32(6):599-601.

［17］ 楊欣，丁彩飛，張永華，等.菟絲子水提物對人精子膜結構和功能氧化損傷的干預作用［J］.中國藥學雜志，2006，41(7): 515-518.

［18］ 徐斯凡，王麗蕃，趙瑩，等.藏黨參多糖對睪丸間質細胞抗氧化作用研究［J］.時珍國醫國藥，2012，23(7):1593-1595.

［19］ 王本祥.現代中藥藥理與臨床［M］.天津:天津科技翻譯出版公司，2004:6.

［20］ 賈敏，楊鐵虹，姚秀娟，等.當歸多糖硫酸酯的抗氧化作用研究［J］.中藥材，2007，30(2):185-188.

［21］ 黃春林，朱曉新.中藥藥理與臨床手冊［M］.北京:人民衛生出版社，2006:653.

Experimental Study of Qiang Jing Jian's Anti Oxidative Effects of the Rats with Little Weak Sperm Induced by Ornidazole

BIN Bin，LU Hai-wang，WANG Jie，WANG De-sheng，XU Jie-xin，QIN Zhi-biao，LIANG Jing-song，PANG Qiu-hua，CUI Jin-zhu
(The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Guangxi，Nanning 530023，China)

Objective:To study the antioxidant effect of Qiang Jing Decoction on epididymis sperms of rats with Ornidazole-Induced oligoasthenozoospermia.Method:60 rats were divided into 4 groups randomly.the model group were given ORN;rats in the Huangjing Zanyu Capsule group were given ORN and Huangjing Zanyu Capsule;rats in the Qiang Jing Decoction group were given ORN Qiang Jing Decoction granule;the blank group were given saline;the concentration and motility of rats’sperms and the epididymis homogenate activity of MDA，SOD，GSH-PX，and NOS as well as the ultrastructure changes of testis and epididymis were detected.Results:Compared to the blank group，the quantity and motility of rats’sperms and the activity of SOD and GSH-PX in model group were reduced significantly，the content of MDA and NOS were highly rose，In Qiang Jing Decoction group and Huangjing Zanyu Capsule group，the sperms quantity and motility and the activity of SOD and GSH-PX were reduced，but significantly higher than model group，while the activity of MDA and NOS significantly lower than the model group.The testis seminiferous epithelial were destroyed and the level structure showed incompletely and the sperm production were decreased.in the model group，while in Qiang Jing Decoction group and Huangjing zanyu Capsule group，the seminiferous epithelial were more completely and the sperm production was approached to the blank group.Conclusion:the Qiang Jing Decoction can enhance the activity of antioxidant enzymes，restraining oxidative stress injury and protecting the spermatogenic function.

Antioxidant;ROS;Oligoasthenozoospermia;Invigorating spleen and kidney;Qiang Jing Decoction

R285.5

:B

:1006-3250(2016)04-0484-04

2015-08-06

國家自然科學基金資助項目(81060297)-健脾益腎法對少、弱精子癥大鼠的抗氧化作用及其調控機制的研究

賓 彬(1964-)，男，廣西平南人，教授，醫學學士，從事男科學與生殖醫學的臨床與研究。

△通訊作者:陸海旺(1986-)，男(壯族)，廣西南寧人，住院醫師，醫學碩士，從事男科疾病的中醫藥臨床與研究，Tel: 15977462577，E-mail:haivang@163.com。