刺老苞總皂苷對(duì)抗大鼠潑尼松性骨質(zhì)疏松的作用研究*

王萌萌，依香叫，崔 箭，裴凌鵬

(中央民族大學(xué)中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院，北京 100081)

刺老苞總皂苷對(duì)抗大鼠潑尼松性骨質(zhì)疏松的作用研究*

王萌萌，依香叫，崔 箭，裴凌鵬△

(中央民族大學(xué)中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院，北京 100081)

目的:研究刺老苞總皂苷對(duì)潑尼松致大鼠骨質(zhì)疏松的對(duì)抗作用。方法:將50只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、潑尼松模型組和刺老苞總皂苷高、中、低(10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg)劑量組各10只。分別灌胃相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)8周后取血清檢測(cè)生化指標(biāo)，對(duì)骨進(jìn)行組織切片檢查及長(zhǎng)度、寬度和骨質(zhì)的測(cè)量。結(jié)果:潑尼松模型組大鼠股骨質(zhì)量、尺骨骨羥脯氨酸(Hyp)和骨鈣含量比正常對(duì)照組明顯降低，脛骨骨髓腔中脂肪組織增多，血漿膽固醇(TG)含量上升，堿性磷酸酶(ALP)和高密度脂蛋白(HDL)含量下降。刺老苞總皂苷組能有效提高骨的質(zhì)量和骨質(zhì)的含量，減少骨髓腔中脂肪的含量，升高堿性磷酸酶和高密度脂蛋白含量。結(jié)論:潑尼松可抑制大鼠的骨生長(zhǎng)及引起骨丟失，刺老苞總皂苷可有良好的對(duì)抗作用。

刺老苞;總皂苷;潑尼松;骨質(zhì)疏松

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以低骨量和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨質(zhì)脆性增加和易于骨折的代謝性疾病。影響骨形成與骨吸收的因素有很多，其中為治療某些免疫性疾病所使用的腎上腺糖皮質(zhì)激素就是導(dǎo)致繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的誘因之一［1］。糖皮質(zhì)激素是由腎上腺皮質(zhì)分泌的激素，幾乎影響全身所有的細(xì)胞和組織。該激素長(zhǎng)期使用一方面促進(jìn)骨骼的分解，使骨骼的生成減少;另一方面可對(duì)抗維生素 D的作用，使鈣從尿中的排出增加，造成體內(nèi)的鈣大量丟失，最終形成骨質(zhì)疏松［2］。因此，如何緩解臨床長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素造成的骨質(zhì)疏松癥，一直以來是人們探討的問題。近年來，傳統(tǒng)中藥(民族藥)相繼在此類疾病的預(yù)防與治療研究中發(fā)現(xiàn)了很多確有療效的化合物成分，再次引起了研究者的關(guān)注。刺老苞為五加科木屬植物楤木(Aralia echinocauIis Hand.Mazz)及其變種白背葉木(Var.nuda Nakai)，其根皮或莖皮可入藥，始載于《本草拾遺》，其味辛、性平，歸肝、腎經(jīng)，功能滋陰健腎、祛風(fēng)濕、壯筋骨、散瘀血、消腫毒，可用于風(fēng)濕痹痛、跌打損傷、骨折等治療［3］。本試驗(yàn)通過長(zhǎng)期服用潑尼松(一類中效糖皮質(zhì)激素)引發(fā)大鼠骨質(zhì)疏松模型，并以此模型來研究刺老苞總皂苷可能的作用效果與調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

全自動(dòng)生化分析儀(奧林巴斯公司)，Labconco冰凍真空干燥儀(法國樂高公司)，J2-SH高速冰凍離心機(jī)(日本島津公司)，752分光光度計(jì)(中國伯樂公司)，刺老苞(湖北恩施醫(yī)藥公司)，醋酸潑尼松、鈣黃綠素、鹽酸四環(huán)素、Goldners染料、總皂苷標(biāo)準(zhǔn)品(美國 SIGMA公司)，Hyp、HDL-C、ALP、TG試劑盒(北京中生生物工程高技術(shù)公司)。

1.2 刺老苞總皂苷制備

1000 g刺老苞曬干后研磨→70%乙醇60 ml回流提取4 h→離心→大孔吸附樹脂柱分離→水洗脫→乙醇洗脫→減壓濃縮→冰凍真空干燥。樣品經(jīng)HPLC及其光譜特征峰與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)鑒定為刺老苞總皂苷，純度為95%。

1.3 動(dòng)物模型建立與分組

SD大鼠50只按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、模型組以及刺老苞總皂苷高、中、低劑量組每組各10只。除正常對(duì)照組外，其余各組給予5 mg/kg潑尼松1 h處理，刺老苞總皂苷高、中、低劑量組分別進(jìn)行30 mg/kg、20 mg/kg、10 mg/kg灌胃，給藥量為5 ml/kg，正常對(duì)照組與模型組均給予5 ml/kg生理鹽水灌胃。每日灌胃1次，連續(xù)8周。第2周末各組大鼠進(jìn)行第1次熒光標(biāo)記(即頸皮下注射鹽酸四環(huán)素2.5 mg/kg)，在第7周末再進(jìn)行第2次熒光標(biāo)記(即頸皮下注射鈣黃綠素5 mg/kg)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 骨物理指標(biāo)及血清生化指標(biāo)的觀察動(dòng)物處死后分離血清，按照試劑盒依次測(cè)量 HDLC、TG及鈣、磷、ALP含量。剝離左側(cè)股骨，稱量濕重后烤干至恒重，分別測(cè)量骨長(zhǎng)(即股骨大轉(zhuǎn)子和股骨頸匯合處最低點(diǎn)到股骨踝間窩的距離)與骨寬(即股骨曲面的第三轉(zhuǎn)子下行至股骨干交接處)。

1.4.2 骨生化指標(biāo)的觀察 取左側(cè)尺骨稱重研碎、灰化2 h，取出骨灰硝酸溶解。經(jīng)處理后，火焰原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定鈣、磷含量。

1.4.3 骨中羥脯氨酸的含量 取右側(cè)尺骨上端稱重研碎，采用氯胺T法測(cè)定羥脯氨酸含量［4］。

1.4.4 骨組織構(gòu)成的觀察 取脛骨上段不脫鈣骨部分，經(jīng)圖像軟件分析髓腔脂肪細(xì)胞、血竇和紅骨髓面積比。骨髓腔面積=紅骨髓面積+白骨髓面積(即脂肪組織面積+血竇面積)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異比較用單因素方差分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x± s)表示，P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 股骨物理指標(biāo)變化

表1顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組股骨濕重、干重均明顯降低(P＜0.01)，表明長(zhǎng)期潑尼松使用可引發(fā)骨質(zhì)顯著變化，但骨長(zhǎng)度、寬度無明顯變化。刺老苞總皂苷不同劑量組的股骨濕重、干重均明顯升高(P＜0.01)，但各劑量組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 股骨物理指標(biāo)變化(±s)

表1 股骨物理指標(biāo)變化(±s)

注:與正常對(duì)照組比較:▲▲P＜0.01;與潑尼松模型組比較:##P＜0.01

組別 例數(shù) 濕重(mg) 干重(mg) 骨長(zhǎng)度(mm) 骨寬度(mm)正 常 對(duì) 照 組34.2±0.5 4.3±0.4 10 908.6±20.1 730.5±17.7 34.5±0.6 4.3±0.3潑 尼 松 模 型 組 10 777.1±17.1▲▲ 554.7±16.5▲▲ 33.7±0.5 4.1±0.2刺老苞總皂苷低劑量組(10mg/kg) 10 820.2±18.2## 660.3±17.1## 33.9±0.5 4.1±0.3刺老苞總皂苷中劑量組(20mg/kg) 10 869.7±19.0## 682.5±17.3## 34.1±0.6 4.2±0.3刺老苞總皂苷高劑量組(30mg/kg) 10 890.3±19.3## 696.1±17.7##

2.2 血清生化指標(biāo)的影響

表2顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組血鈣、TG含量有所升高(P＜0.01)，而HDL、血磷、ALP含量有所下降(P＜0.01)。與模型組比較，刺老苞總皂苷不同劑量組均明顯升高HDL、血磷、ALP含量(P＜0.01)，降低TG含量(P＜0.01)。

表2 血清生化指標(biāo)變化(±s)

表2 血清生化指標(biāo)變化(±s)

注:與正常對(duì)照組比較:▲▲P＜0.01;與潑尼松模型組比較:##P＜0.01

組別 例數(shù) 血鈣(mmol/L)血磷(mmol/L) ALP (IU/L) HDL (mg/dL) TG (mg/dL)正 常 對(duì) 照 組 10 2.5±0.3 2.7±0.3 119.5±18.2 55.8±2.5 143.8±23.3潑 尼 松 模 型 組 10 2.9±0.3▲▲ 1.8±0.2▲▲ 76.0±14.1▲▲ 34.4±2.2▲▲ 178.5±30.1▲▲刺 老 苞 總 皂 苷 10 2.8±0.5 2.2±0.3## 104.0±15.5## 45.1±2.2## 151.8±24.4##低 劑 量 組 (10 mg/kg)刺 老 苞 總 皂 苷 10 2.8±0.5 2.2±0.3## 109.8±16.1## 48.9±2.5## 146.1±23.2##中 劑 量 組 (20 mg/kg)刺 老 苞 總 皂 苷 10 2.7±0.4 2.4±0.3## 113.5±17.0## 52.8±2.2## 144.8±24.5##高 劑 量 組 (30 mg/kg)

2.3 尺骨生化指標(biāo)變化

表3顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組尺骨質(zhì)量、Hyp、Ca、P含量均明顯降低(P＜0.01)，表明長(zhǎng)期使用潑尼松可引發(fā)骨有機(jī)質(zhì)喪失。與模型組比較，刺老苞總皂苷不同劑量組均可增加尺骨質(zhì)量和Hyp、Ca、P含量(P＜0.01)。

表3 尺骨生化指標(biāo)變化(±s)

表3 尺骨生化指標(biāo)變化(±s)

注:與正常對(duì)照組比較:▲▲P＜0.01;與潑尼松模型組比較:##P＜0.01

組別 例數(shù) 骨重(mg) 羥脯氨酸(μg/mL) Ca(μg/mL) P(μg/mL)正 常 對(duì) 照 組 10 179.3±18.8 123.2±14.0 640.0±23.2 250.9±22.1潑 尼 松 模 型 組 10 140.1±17.2▲▲ 91.9±13.1▲▲ 600.1±22.0▲▲ 201.3±21.1▲▲刺 老 苞 總 皂 苷 10 145.9±18.3## 100.2±13.3## 615.9±23.0## 220.8±22.0##低 劑 量 組 (10 mg/kg)刺 老 苞 總 皂 苷 10 158.8±18.0## 107.1±14.0## 619.2±22.1## 233.0±22.2##中 劑 量 組 (20 mg/kg)刺 老 苞 總 皂 苷 10 169.1±18.5## 119.1±13.9## 623.5±23.2## 237.9±23.0##高 劑 量 組 (30 mg/kg)

2.4 脛骨骨組織構(gòu)成變化

表4顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組脛骨骨髓腔中骨髓面積增加而紅骨髓減少(P＜0.01)，白骨髓中脂肪組織增多(P＜0.01)，表明潑尼松可引發(fā)大鼠骨髓的脂肪化。與模型組比較，刺老苞總皂苷不同劑量組均可使骨髓腔內(nèi)脂肪組織減少，血竇組織增加(P＜0.01，P＜0.01)。

表4 脛骨骨髓組織構(gòu)成面積百分率變化(±s)

表4 脛骨骨髓組織構(gòu)成面積百分率變化(±s)

注:與正常對(duì)照組比較:▲▲P＜0.01;與潑尼松模型組比較:##P＜0.01

組別 例數(shù) 紅骨髓(%) 白骨髓(%) 脂肪組織(%) 血竇組織 (%) 10 73.0±5.7 22.0±3.1 17.2±2.3 15.9±2.3潑 尼 松 模 型 組 10 49.0±4.0▲▲ 47.1±4.0▲▲ 33.2±3.0▲▲ 12.3±2.1▲▲刺 老 苞 總 皂 苷 10 70.9±5.3## 31.0±3.0## 13.2±2.2## 15.0±2.0##低 劑 量 組 (10 mg/kg)刺 老 苞 總 皂 苷 10 72.3±5.1## 28.3±3.4## 14.6±2.2## 15.2±2.2##中 劑 量 組 (20 mg/kg)刺 老 苞 總 皂 苷 10 74.1±5.6## 25.7±3.2## 15.7±2.1## 15.5±2.3##高 劑 量 組 (30 mg/kg)正 常 對(duì) 照 組

3 討論

糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GCS)是由腎上腺皮質(zhì)中束狀帶分泌的一類甾體激素，主要為皮質(zhì)醇(cortisol)，具有調(diào)節(jié)糖、脂肪和蛋白質(zhì)的生物合成和代謝作用，還具有抑制免疫應(yīng)答、抗炎、抗毒、抗休克作用。此類激素目前主要分為內(nèi)源性(如可的松、氫化可的松)與外源性(潑尼松、地塞米松等)，臨床上長(zhǎng)期使用可導(dǎo)致嚴(yán)重的骨性合并癥(如骨質(zhì)疏松及椎骨壓迫性骨折)，并伴有股骨頭壞死［5］。研究表明，潑尼松長(zhǎng)期使用可誘發(fā)大鼠負(fù)重骨的骨量丟失，松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，骨的脆性增高、韌性下降，骨質(zhì)減退，呈現(xiàn)骨質(zhì)疏松狀態(tài)，且病變程度與潑尼松使用劑量呈正相關(guān)性。與此同時(shí)，潑尼松長(zhǎng)期使用可增強(qiáng)大鼠破骨細(xì)胞活性，促進(jìn)骨吸收過程，加速骨質(zhì)溶解，抑制骨細(xì)胞分泌骨質(zhì)，并引起體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，造成骨髓脂肪細(xì)胞增多，引起骨髓腔內(nèi)壓增高而使血流減慢，從而影響了骨內(nèi)血供而抑制骨代謝有關(guān)［6-10］。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證實(shí)，長(zhǎng)期服用潑尼松確實(shí)可誘發(fā) SD大鼠骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，其各項(xiàng)骨組織與血清生化、物理指數(shù)與以往報(bào)道結(jié)果基本一致［11］。與模型組比較，不同劑量刺老苞總皂苷灌胃后的SD骨質(zhì)疏松癥大鼠可不同程度上有效改善與影響上述各項(xiàng)指數(shù)，治療骨質(zhì)疏松癥與影響其病程發(fā)展，但就其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。

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Study on the Effect of Total Saponins of Old Thorn Bract on Rat Osteoporosis Induced by Prednisone

WANG Meng-meng，YI Xiang-jiao，CUI Jian，PEI Ling-peng△
(MINZU University，Institute of Minority Traditional Medicine Research，Beijing 100081，China)

Objective:To investigate the effect of Aralia echinocauIis Hand.Mazz total saponin on osteoporosis，which was induced by prednisone in rats.Methods:Fifty SD rats were randomly divided into control group，prednisone group，Aralia echinocauIis Hand.Mazz total saponin low dosage group(10 mg/kg)，middle dosage group(20 mg/kg)and high dosage group(30 mg/kg).Rats in the control group were treated with dissolvent，the others were treated with prednisone firstly，and then，the rats in prednisone group were treated with dissolvent，the Aralia echinocauIis Hand.Mazz total saponin different groups were treated with related dosage extracts，respectively，once a day.After 8 weeks，the bone histomorphometric analysis of thighbone was performed，the content of Ca，P and hydroxyproline(Hyp)in ulna were measured，the length and width of the thighbone were tested.Results:The bone weight，bone Hyp and bone Ca in prednisone group were lower than those in control group.The fat in the marrow，the cholesterol in marrow increased but alkaline phosphatase(ALP)and high-density-lipoprotein(HDL)were reduced.Aralia echinocauIis Hand.Mazz total saponin can increase bone weight，reduce the fat in the marrow and increase the ALP and HDL.Conclusion:Prednisone can restrain bone growth and increase bone loss，while Aralia echinocauIis Hand.Mazz total saponin has good protective effect.

Aralia echinocauIis Hand.Mazz;Total saponin;Prednisone;Osteoporosis

R274.9

:B

:1006-3250(2016)04-0477-03

2015-08-20

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81173361，81270051，81473451)-基于骨血管重構(gòu)耦聯(lián)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)探討刺老苞根皮有效成分群干預(yù)骨折愈合的分子機(jī)制，基于Wnt/β-catenin與TGF-β/BMPs信號(hào)耦聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的刺老苞根皮干預(yù)骨折愈合分子機(jī)制研究，基于3D打印技術(shù)與分子信號(hào)網(wǎng)絡(luò)理論研究刺老苞根皮有效成分群調(diào)控骨折愈合作用機(jī)制

王萌萌(1979-)，女，山東人，在讀博士，從事民族醫(yī)藥的研究。

△通訊作者:裴凌鵬(1976-)，男，湖南人，副研究員，醫(yī)學(xué)博士，從事民族藥與臨床醫(yī)學(xué)研究，Tel:13520801809，E-mail: lppei@hotmail.com。