CaM/CaMKⅡ在脾氣虛證大鼠腦腸微環境中的表達及四君子湯干預效應研究*

田 茸，鞏子漢，楊曉軼，朱立鳴，段永強，成映霞，杜 娟，王 燕

(1.成都中醫藥大學，成都 611137;2.甘肅中醫學院，蘭州 730020)

【實驗研究】

CaM/CaMKⅡ在脾氣虛證大鼠腦腸微環境中的表達及四君子湯干預效應研究*

田 茸1，鞏子漢2，楊曉軼2，朱立鳴2，段永強2，成映霞2，杜 娟2，王 燕2

(1.成都中醫藥大學，成都 611137;2.甘肅中醫學院，蘭州 730020)

目的:從CaM信號通路關鍵基因揭示脾氣虛證發生及益氣健脾法干預作用機制。方法:脾氣虛證大鼠為研究對象，采用實時熒光定量RT-PCR、Western Blot技術檢測不同階段大鼠腦、腸CaM信號通路關鍵基因CaM/CaMKⅡmRNA和蛋白的動態表達，并分析四君子湯干預效應機制。結果:從大鼠小腸組織看，脾氣虛證大鼠相對于正常大鼠CaM/CaMKⅡmRNA和蛋白表達升高，經四君子湯治療后明顯降低;從大鼠腦組織看，脾氣虛證大鼠相對于正常大鼠CaM/CaMKⅡmRNA和蛋白表達降低，經四君子湯治療后明顯升高。結論:腦腸微環境中CaM信號傳導通路關鍵基因CaM/CaMKⅡ的動態表達與脾氣虛證形成有關，四君子湯通過影響其表達對脾氣虛證起到時相性動態干預。

脾氣虛證;四君子湯;腦;腸;CaM;CaMKⅡ

中醫學歸納“脾”為氣血生化之源、后天之本，主司運化、主統血、主肌肉四肢，脾氣虛證以面黃食少、泄瀉或便秘、神疲乏力、少氣懶言、舌淡苔白、脈虛弱為臨床辨證要點。故脾氣虛證是以消化吸收功能障礙為主要表現，并涉及神經、免疫、內分泌、運動等系統調節紊亂、營養物質代謝低下的虛損性疾病狀態，是多系統和多器官功能衰弱的綜合病理變化［1］。鑒于中醫之“脾”是以消化系統為主體，并涉及多系統的綜合功能性單位，故本研究將靶標定位到腦、腸微環境下，分別檢測大鼠腦和小腸CaM信號通路關鍵基因CaM/CaMKⅡmRNA和蛋白的表達，從而探討脾氣虛證的形成機制，并在此基礎上探討四君子湯對脾氣虛證的治療機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

采用SPF級 Wistar雄性大鼠，體質量(170± 20)g，由甘肅中醫學院醫學實驗中心提供(動物合格證號 SCXK［甘］2011-0001-0001011)。大鼠適應性飼養3 d后，按體質量編號依照隨機數字表法分為正常對照組、模型14 d組、模型21 d組、模型28 d組、四君子湯14 d組、四君子湯21 d組、四君子湯28 d組，分籠飼養。

1.2 藥物及試劑

造模藥材大黃、枳實、厚樸(4∶2∶3)，灌胃藥材人參、白術、茯苓、炙甘草(3∶3∶3∶2)，購自蘭州復興厚中藥材有限責任公司，常規煎煮，濾液濃縮至折合原藥材質量濃度2 g/ml備用。主要實驗試劑:辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L，批號ZB-2301)，Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co Ltd;總蛋白提取試劑盒(批號 PC0020)，北京普利萊基因技術有限公司;蛋白質定量試劑盒(BCA法，批號P1511)，北京普利萊基因技術有限公司;反轉錄試劑盒(批號0000036802)，美國 Promega公司;實時熒光 定 量 PCR 試 劑 盒 (批 號 0000036802，0000042197)，美國 Promega公司;Cam、CaMKⅡ引物，寶生物工程(大連)有限公司;Anti-Calmodulin antibody，Rabbit monoclonal［EP799Y］to Calmodulin，ab45689)，abcam公司(1/1000-1/5000);Anti-CaMKⅡ antibody:Rabbit monoclonal［EP1829Y］to CaMKⅡ，ab52476)，abcam公司(1/20000)。

1.3 模型復制及給藥

1.3.1 模型復制 以苦寒破氣加游泳力竭雙因素法復制脾氣虛證模型?？嗪茪夥?模型組大鼠每日按7.5 g/kg·d大黃枳實厚樸制劑液灌胃;游泳力竭法:大鼠每日負重游泳，于大鼠尾根部纏繞質量為該大鼠體質量 10% 的保險絲，放入水深 50 cm、20℃的水槽中游泳，以游泳力竭(即大鼠鼻尖沒入水面10 s)為度，判定游泳力竭。脾氣虛證模型復制成功評估標準依據衛生部藥政局頒布的《中藥治療脾氣虛證的臨床研究指導原則》擬定:①蜷縮扎堆1分;②瞇眼弓背1分;③食量減少1分;④體質量減輕1分;⑤便形質軟1分;⑥便形溏稀2分;⑦肛溫下降2分;⑧游泳耐力下降1分。9項癥狀表現中出現6項則可判斷為脾氣虛證。結合評估標準以及大鼠體質量增長幅度、進食量、游泳力竭時間、胃殘留率、小腸推進率等定量指標評判大鼠脾氣虛證模型復制成功。

1.3.2 分組給藥 各四君子湯組大鼠在造模7 d后繼續造模的同時，每天以四君子湯20 g/kg·d藥劑灌胃進行干預治療，灌胃容積均為1 ml/100 g，連續灌胃3周(四君子湯用藥量以臨床等效劑量為標準，實驗等效劑量按人與動物體型系數折算［2］，相當于60 kg成人每日臨床用量的10倍)。正常對照組、各模型組以相應等體積的蒸餾水灌胃28 d。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 取材 實驗于14 d、21 d、28 d末分別斷椎處死相關組別大鼠，冰臺上迅速取腦，分離海馬組織，并截取十二指腸上段組織備用。

1.4.2 實時熒光定量 PCR檢測各組大鼠小腸、腦組織CaM/CaMKⅡ基因表達 組織總RNA提取與質量檢測及反轉錄合成模板 cDNA:取適量各樣本組織，分別取1 μL各組織RNA樣品用核酸定量分析儀測定其 OD260/OD280均在1.8～2.0之間，經總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測，提取的RNA符合純度要求，可用于后續PCR。按照反轉錄試劑盒要求操作，所得的單鏈 cDNA放置于－20℃保存備用。引物設計與實時熒光定量PCR:從NCBI中查尋目標基因ID及序列，由TAKARA公司設計和合成目標基因引物。β-actin引物序列，上游:5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，下游:5'-GAC TCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'，擴增長度:150 bp; CaM引物序列，上游:5'-TCAGAACCCAACAGAGG CTGAA-3'，下游:5'-GTCAAAGACTCGGAATGCCT CAC-3'，擴增長度:160 bp;CaMKII引物序列，上游: 5'-GATGTGCGACCCTGGAATGA-3'，下游:5'-ATGT AGGCGATGCAGGCTGAC-3'，擴增長度:183 bp。實時熒光定量PCR以β-Actin作為內參基因，得到各擴增反應的Ct值。連續檢測熒光并記錄擴增曲線，采用樣點擬合法分析結果得到目的基因和 β-actin的Ct值，用比較Ct值法計算相對表達量。

1.4.3 Western blot檢測各組大鼠小腸、腦組織CaM/CaMKⅡ蛋白表達 組織蛋白提取:分別將小腸、腦組織裂解剪成碎片勻漿，直至95%的細胞被破碎，離心后吸取上清液得組織總蛋白產物并蛋白純化。蛋白定量:組織蛋白定量檢測采用 BCA (Bicinchoninic acid)蛋白質測定方法，以 BSA標準蛋白濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，并根據所測樣本的吸光度值，在標準曲線上計算樣品的蛋白含量;樣本組織蛋白變性:分別取各組織樣本300 μL于離心管中，再加入100 μL 4×SDSPAGE蛋白上樣緩沖液充分混勻，沸水(100℃)中水浴10 min冰水浴冷卻，－20℃冰箱保存;溶液配制;制膠與電泳;轉膜結束后，打開轉移夾，PVDF膜上可見清晰的預染 Marker，表明蛋白已轉移至PVDF膜上，根據抗體說明中目標抗體的分子量分大小確定目標蛋白位置;免疫檢測:將PVDF膜放入適量封閉液中，37℃恒溫水浴搖床上封閉2 h，放入平皿中，并加入相應的一抗溶液(GAPDH一抗溶液配制(1∶700):牛奶封閉液7 ml，GAPDH一抗10 ul; CamKⅡ一抗溶液配制(1∶10000):封閉液10 ml，CamKⅡ一抗1 ul;Cam一抗溶液配制(1∶500):封閉液5 ml，Cam一抗1 ul、37℃恒溫水浴搖床上封閉2 h，再將PVDF膜放置于10 mlTBST溶液中，搖床上洗膜3次、10 min/次，將洗好的 PVDF膜放于配制好的二抗溶液(二抗溶液配制:辣根酶標記山羊抗兔(1∶7500):山羊抗兔二抗 2 μL，牛奶封閉液 15 ml)，搖床上孵育2 h再洗膜;采用 ECL法顯色，并根據不同顯影光強度調整曝光條件，用 Bio-RAD Quantity one圖像分析軟件進行掃描分析。結果用Quantity one分析光密度值對蛋白含量進行分析，以β-actin與目的蛋白密度比值作為待測目的蛋白相對表達量。

1.5 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析，以均數±標準差(±s)表示。首先進行正態性、方差齊性檢驗，滿足正態性者不同組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠的一般情況改變

正常對照組大鼠飲食、活動、大便性狀及毛發等均無異常，體質量穩定逐漸增加。各模型組大鼠從14 d開始逐漸出現活動減少、毛發枯槁(背脊毛色從白到紅再轉黃)，逐漸出現瞇眼弓背，喜扎堆，體質量下降，進食量減少，大便稀軟;造模21 d后部分大鼠出現大便稀溏，少數出現水樣便或肛門脫垂;造模28 d多數大鼠便質清稀，少數出現便秘。各四君子湯組大鼠的一般情況均較模型組有所改善，并隨著治療時間的延長，大鼠進食量增加、活動增多，瞇眼弓背和扎堆現象減少，大便性狀接近正常。

2.2 各組大鼠體質量、進食量、游泳力竭時間的動態變化

表1顯示，模型組大鼠在造模14 d時與正常對照組比較，體質量、進食量、游泳力竭時間均明顯偏低(P＜0.01，P＜0.05);隨造模時間延長，此3項指標均呈下降趨勢，明顯落后于正常對照組(P＜0.01)。四君子湯組在造模和治療初期與正常對照組比較，體質量、進食量、游泳力竭時間明顯偏低(P＜0.01，P＜0.05)，經過28 d的治療，體質量增長幅度至每7 d增長13～15 g，但由于體質量基數低，故仍低于正常對照組(P＜0.01)卻明顯高于模型組(P＜0.01)，每日進食量及游泳力竭時間均有所增加，基本接近正常對照組且高于模型組(P＜0.01)。

表1 治療14 d大鼠體質量、進食量、游泳時間表

2.3 各組大鼠胃殘留率、小腸推進率動態變化

表2顯示，隨造模時間延長模型組大鼠與正常對照組比較，胃殘留率、小腸推進率呈升高趨勢，到28 d時均明顯高于正常對照組(P＜0.01，P＜0.05);四君子湯組在造模和治療初期與正常對照組比較，胃殘留率略低，小腸推進率略高，但差異無統計學意義。經過28 d的治療，胃殘留率、小腸推進率有所降低，均明顯低于模型組(P＜0.01，P＜0.05)。

表2 各組大鼠胃殘留率、小腸推進率比較

2.3 各組大鼠腦、小腸組織 CaM/CaMKⅡmRNA和蛋白相對表達量 表3、4顯示，通過實時熒光定量RT-PCR和Western Blot技術檢測顯示，腦組織中模型組大鼠CaM/CaMKⅡ mRNA和蛋白的表達隨造模時間的延長呈下降趨勢，在造模第21、28天時，其表達明顯低于正常對照組(P＜0.01)。四君子湯組在治療初期，CaM/CaMKⅡ mRNA和蛋白表達也略低于正常對照組，隨治療時間的延長表達逐漸升高，至治療第21、28天時其表達明顯高于模型組(P＜0.01，P＜0.05)。從小腸組織看，模型組大鼠CaM/CaMKⅡmRNA和蛋白相對表達，隨造模時間的延長呈上升趨勢，在造模第21、28天時其表達明顯高于正常對照組(P＜0.01，P＜0.05)。四君子湯組在治療初期，CaM/CaMKⅡ mRNA和蛋白表達也略高于正常對照組，隨著治療時間的延長表達逐漸降低，至治療第21、28天時其表達明顯低于模型組(P＜0.01)。

3 討論

中醫證候的客觀化研究是中醫學發展和完善的前提和基礎。脾氣虛證是脾病辨證中的基礎證，加之脾氣虛證牽涉多臟器、多系統，故本課題基于細胞信號傳導理論，將與機體多系統多臟器生理功能密切相關的鈣調蛋白信號傳導途徑關鍵基因CaM/CaMKⅡ的表達作為檢測指標，提出“CaM信號傳導途徑在脾氣虛證腦腸微環境中的可能作用機制”工作假說，從而對脾氣虛證證候實質進行客觀化研究。

表3 各組大鼠腦、小腸組織CaM/CaMKⅡmRNA相對表達量比較

表4 各組大鼠腦、小腸組織CaM/CaMKⅡ蛋白相對表達量比較

研究結果證明，復制脾氣虛證模型的大黃枳實厚樸活性物質苦寒破氣，有可能影響到胃蠕動，使胃排空時間延長并導致食積，同時又興奮小腸平滑肌，使得小腸收縮功能亢進導致泄瀉，說明大黃枳實厚樸成功復制了脾氣虛證模型，模擬了脾氣虛證患者的神疲乏力、少氣懶言、倦臥多寐、胃納不香、納食減少、停食積食、大便稀溏及小兒出現生長發育遲緩等癥狀。經過四君子湯活性物質益氣健脾，促進胃蠕動，縮短胃排空時間，減少食積的發生，同時調節小腸的推進功能，加強小腸對營養物質的吸收，從而改善大鼠的一般情況，恢復體質量增長幅度，加強運動耐力并改善便質，說明四君子湯能從整體上改善脾氣虛證患者的一般情況，對脾氣虛證相應癥狀都有很好的治療效果。

從證候實質的角度發現，脾氣虛證證候與腦腸中CaM/CaMKⅡmRNA和蛋白的表達水平之間存在動態多時相效應關系，即脾氣虛證大鼠隨造模時間的延長，與正常大鼠比較小腸組織中CaM/CaMKⅡ的mRNA和蛋白表達明顯升高，腦組織中 CaM/ CaMKⅡ的mRNA和蛋白表達明顯降低，說明大黃枳實厚樸活性物質具有增強大鼠小腸組織中CaM/ CaMKⅡ的mRNA和蛋白表達，并抑制大鼠腦組織中CaM/CaMKⅡ的mRNA和蛋白表達的作用，揭示了脾氣虛證證候的細胞信號通訊機制。與此同時，在遵循傳統中醫治則治法理論基礎上，通過觀察益氣健脾法的代表方劑四君子湯對脾氣虛證大鼠的干預作用發現，隨四君子湯治療時間的延長，與脾氣虛證大鼠比較治療后大鼠小腸組織中CaM/CaMKⅡ的mRNA和蛋白表達明顯降低，腦組織中CaM/CaMKⅡ的mRNA和蛋白表達明顯升高，說明四君子湯活性物質具有抑制脾氣虛證大鼠小腸組織中CaM/CaMKⅡ的mRNA和蛋白表達，并促進脾氣虛證大鼠腦組織中CaM/CaMKⅡ的mRNA和蛋白表達的作用。從基因和蛋白水平探尋到中醫藥治療脾氣虛證證候的作用靶位和機制，為今后進一步揭示中醫藥治療脾氣虛證多時相、多靶點的科學內涵打下基礎。

［1］ 錢澤南，錢會南.脾氣虛證與神經-內分泌-免疫調節相關機制研究［J］.遼寧中醫雜志，2010，37(3):401-403.

［2］ 陳奇.中藥藥理研究方法學［M］.北京:人民衛生出版社，1993:33-34.

Expression of CaM/CaMK II and the Intervention effect of Si Jun Zi Decoction in the Brain and Intestine Micro-environment of Rats with Spleen Qi Deficiency Syndrome

TIAN Rong1，GONG Zi-han2，YANG Xiao-yi2，ZHU Li-ming2，DUAN Yong-qiang2，CHENG Ying-xia2，DU Juan2，WANG Yan2
(1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，China; 2.Gansu College of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China)

Objective:To reveal the mechanism about the expressions of key genes of CaM signal pathway of the spleen qi deficiency rats，and the intervention effects about strengthening spleen and benefiting qi.Methods:We took the spleen qi deficiency rats as the targets，We detected dynamic expressions of critical genes CaM/CaMKⅡmRNA and protein on CaM signaling pathway in brain and intestine microenvironments at different time by technique methods of real-time quantitative RT-PCR and Western Blot.At the same time we studied on the intervention effect mechanism of Sijunzi Decoction to treat spleen qi deficiency rats.Results:1 Rat intestinal detection index:Spleen qi deficiency rats intestinal CaM/CaMKⅡmRNA and proteins expressions increased compared with normal rats.After the treatment of Sijunzi Decoction rats intestinal CaM/ CaMKⅡmRNA and proteins expressions reduced compared with spleen qi deficiency rats.2 Rat brain detection index: Spleen qi deficiency rats brain CaM/CaMKⅡmRNA and proteins expressions reduced compared with normal rats.After the treatment of Sijunzi Decoction rats brain CaM/CaMKⅡmRNA and proteins expressions increased compared with spleen qi deficiency rats.Conclusions:The dynamic expressions of key genes CaM/CaMKⅡof CaM signal pathway in brain and intestine microenvironment，which is the basis for spleen qi deficiency syndrome.Sijunzi Decoction treated spleen qi deficiency by affecting the dynamic expressions of CaM/CaMKⅡ.

Spleen deficiency;Sijunzi Decoction;Brain;Intestine;CaM;CaMK Ⅱ

R285.5

:B

:1006-3250(2016)04-0468-04

2015-08-06

國家自然科學基金資助項目(81160420);甘肅省自然科學基金資助項目(1010RJZA148);甘肅省教育廳基金資助項目(1006-05)

田 茸(1978-)，女，主治醫師，副教授，醫學博士，碩士研究生導師，從事中醫藥防治脾胃病的臨床與實驗研究。