側流免疫法在臨床即時檢測中的應用研究進展

肖忠華,黃海兵 綜述，郝 坡 審校

(重慶三峽醫藥高等專科學校醫學技術系/重慶市抗腫瘤天然藥物工程技術研究中心 404120)

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·綜 述· doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.28.043

側流免疫法在臨床即時檢測中的應用研究進展

肖忠華,黃海兵 綜述，郝 坡△審校

(重慶三峽醫藥高等專科學校醫學技術系/重慶市抗腫瘤天然藥物工程技術研究中心 404120)

側流免疫法；即時檢驗；信號探針；多組分檢測

即時檢驗(point of care testing,POCT)是當今臨床檢驗發展的趨勢之一。側流免疫法，最早被稱為“溶膠粒子免疫法”，它是以含有被粒子標記的待測抗原(抗體)或被粒子標記的免疫復合物[待測抗原(抗體)]與被粒子標記的抗體(抗原)生成的免疫復合物]的液體樣品或提取溶液為流動相，以固定有檢測線和控制線的條狀聚合物層析材料為固定相，流動相通過毛細作用在固定相中向前移動的過程中，流動相中所含被粒子標記的待測抗原(抗體)或免疫復合物與被固定在檢測線上的抗體(抗原)發生特異性免疫反應而被捕獲，形成檢測線；而流動相中未被捕獲的游離的以粒子標記的待測抗原(抗體)或免疫復合物則與被固定在控制線上的抗體(抗原)或抗-IgG發生免疫反應，形成控制線；之后，通過測量并比較檢測線和控制線上標記粒子的光、電、磁、電化學等信號強弱來定性、半定量和定量測定待測抗原或抗體的方法，又稱為免疫層析法[1]。由于側流免疫法簡便、快速，在病毒、病原微生物、寄生蟲、糖、脂、蛋白質、核酸等臨床檢驗對象的POCT中獲得了廣泛的應用。近年來，隨著納米材料的興起，一批生物相容性好并具有良好電、光、磁、電化學等性質的納米粒子被發展為高靈敏度的光信號、磁信號、電化學信號探針，這些高靈敏度探針和信號探針的便攜式檢測設備(如適配手機的便攜檢測裝置)，以及信號探針檢測手機應用程序等的應用，使得側流免疫法在高靈敏度和定量方面取得了長足的進步。本文簡要歸納總結側流免疫法在臨床POCT應用研究中可視化、熒光等高靈敏度探針和多組分檢測的進展。

1 高靈敏度信號探針

1.1 可視化探針 納米金、膠乳微粒是最常見的可視化探針[1]，可視化探針與圖像處理設備聯用可提高靈敏度和實現定量檢測。近年膠乳微粒作為可視化探針研究報道較少，而采用多種方法對納米金可視化探針信號放大以降低檢出限較多。Zhu等[2]以13 nm金納米標記肌鈣蛋白檢測抗體(同時將標記有生物素的單鏈DNA標記在金納米上)作為信號探針固定在第二連接區，以標記上親和素的41 nm金納米固定在第一連接區，檢測線固定肌鈣蛋白捕獲抗體，由于利用了生物素-親和素連接的較大顆粒金納米作為信號放大，使得雙抗夾心側流免疫法測定肌鈣蛋白檢測限低至1 ng/mL。Jue等[3]以聚乙二醇2000包覆膠體金為探針側流免疫法測定從大腸埃希菌培養液標本中提取的高鹽基質中的模式病毒噬菌體M13，減少了高鹽基質造成膠體金吸附的抗體的脫附影響，其檢測限比不用聚乙二醇處理提高了10倍。Yang等[4]以聚丙烯酸包覆核殼結構的四氧化三鐵/金納米負載梅毒螺旋體抗原側流免疫法檢驗梅毒螺旋體抗體含量，由于采用核殼結構使得單位面積負載的金納米增多，負載的抗原增多，同時采用聚丙烯酸包覆在整個金納米殼外層也增加了探針的單分散性和穩定性，抑制了探針的聚集，其檢測限低至1 U/mL。Xu等[5]采用金納米包覆的硅納米棒作為探針，由于硅納米棒表面積大，負載納米金多，連接的抗體多，大大提高了納米金復合探針的靈敏度，其檢測限低至0.01 ng/mL。可見，通過增加負載金納米材料的表面積和通過帶負電荷的聚合物處理抑制納米金的聚集可以提高納米金探針可視化檢測的檢測限，而最常采用的銀增強的納米金探針信號放大技術，因需額外加入銀離子增加反應程序和延長反應時間而較少應用。無定型碳納米的生物分子相容性好，Linares等[6]以生物素親和素為模型分析物系統比較了無定型納米碳黑100、銀增強金納米、金納米、藍色膠乳顆粒的靈敏度，它們的檢測限按上述順序依次增加，無定型納米碳黑100檢測限最低，表明無定型碳納米作為可視化探針的誘人前景[7]。

1.2 熒光探針 有機染料熒光微球是目前最為常用的一類熒光探針，而當前的研究熱點則是量子點探針、鑭系螯合物摻雜無機熒光探針和鑭系摻雜無機上轉換發光熒光探針。

鑭系摻雜上轉換發光材料是具有低能量激發(近紅外)和高能量發射(紫外-近紅外)的反斯托克位移材料，化學穩定性高、熒光量子產率高、低毒性、無背景熒光干擾，作為熒光探針可獲得很高的信噪比，而且，其近紅外的激發光能不為生物組織所吸收，不會破壞生物樣本，因此，在臨床生物檢驗和診療中獲得廣泛應用[8]。Van Dam等[9]系統評估鑭系摻雜上轉換發光熒光探針側流免疫法與酶聯免疫法測定血吸蟲陽極抗原的診斷性能：低濃度區域上轉換發光熒光探針側流免疫法更靈敏，檢測限低至30 pg，變異系數更小，而且其檢驗結果18個月前后兩次測定保持一致，這表明上轉換發光探針側流免疫法有很強的耐受性。

稀土螯合物摻雜的熒光物質Stoke位移長、發射譜帶窄、熒光強度高，是熒光微球研究者關注的焦點領域之一。銪螯合物摻雜的熒光微球是鑭系稀土螯合物摻雜熒光微球最有前途的種類之一。Juntunen等[10]比較了銪螯合物摻雜聚苯乙烯熒光微球和膠體金作為側流免疫探針測定生物素-BSA和PSA的檢測限，分別提高了300倍和7倍。Xia等[11]將銪螯合物包被在硅納米球表面作為探針，由于表面積更大的硅球結合的銪螯合物摻雜的熒光分子增多，產生了更大的斯托克位移，能發射更容易分辨的615 nm長波光譜，以該探針測定乙型肝炎表面抗原的檢測限低至0.03 μg/mL，比以膠體金作為探針的檢測限降低了100倍。新近上市的商品化銪螯合物摻雜熒光微球為熒光探針的沙眼衣原體側流免疫試劑盒在臨床大樣本系統評估中檢測限也達到了0.27 ng/mL[12]。量子點具有較寬激發光譜、較窄發射光譜、高量子產率、發光穩定、幾乎無光褪色現象，而且生物相容性好，可同時連接幾個生物分子，是較好的熒光探針[8]。由于量子點粒徑較小，需要在制備過程中加入巰基丙酸、巰基乙胺等穩定劑，防止其團聚而淬滅，依其穩定劑的種類可分為水溶性量子點和油溶性量子點。水溶性量子點可直接作為熒光探針[13]，也可以加入試劑使得納米金被還原的同時量子點熒猝滅等[14]間接方法作為熒光探針。采用表面積和粒徑更大的硅納米、磁性納米等負載更多粒徑小的量子點是提高量子點熒光探針靈敏度的常用手段[15]。對于油溶性量子點，研究者則嘗試共價連接極性有機分子或以相轉移、微乳液等方法包被納米硅或聚合物來改善其水溶性，提高其在側流層析相轉移過程中的化學穩定性和膠態穩定性。Li等[16]采用兩性分子丙烯酸叔丁酯-丙烯酸乙酯-丙烯酸甲酯共聚物自組裝包被量子點納米珠側流免疫法檢測PSA，檢測限低至0.33 ng/mL。Zhou等[17]以微乳液法制備聚苯乙烯量子點(紅、綠、藍三種顏色)復合納米球作為探針，側流免疫法測定AFP，不僅檢測限可低至0.1 ng/mL,而且可耐受更高的溫度、更高鹽濃度、更極端pH。盡管如此，與鑭系摻雜上轉換發光材料相比較，量子點的毒性和高能激發下的自發熒光則是其不足之處。

1.3 散射探針 納米金屬或以聚合物或硅包封的納米金屬可為散射探針，其中,納米金和納米銀最為常用[18]。You等[19]以3D打印技術設計打印可安裝在手機上的適配裝置使得試紙條與手機相機(CCD或CMOS)發出的入射光呈65°夾角(此時檢測器與入射光呈110°夾角)來最小化硝酸纖維素膜的米氏散射，從而最大化納米金探針的瑞利散射，結合自主開發的手機應用，側流免疫法測定TSH的檢測限可低至0.31 mIU/mL。Noble等[20]以巰基化玻璃包封金納米的核殼復合納米(金為核，玻璃為殼)作為表面增強拉曼探針，側流免疫法檢驗cTnI的檢測限低至38 pmol，與熒光探針側流免疫法檢測限相當。這些研究結果表明納米金屬作為散射探針比作為可視化探針靈敏度更高，并可采用可視化和散射兩種檢測模式來定性定量。同時啟發研究者可探索其他具有光散射特性的納米金屬粒子作為瑞利散射、表面增強拉曼、共振散射探針。

1.4 磁性探針 磁性材料不僅可作為改善其他核殼型粒子探針分析性能的磁核和磁性分離載體，還可直接作為磁性探針。其作為磁性探針具有以下優點：磁性可完全被磁性記錄儀捕獲，樣本中磁性物質少而引起的干擾少，因而可提高側流免疫靈敏度，并且磁性數月內很穩定，耐受性好[21]。Workman等[22]以順磁性磁珠作為磁性探針標記HIV p24抗原的抗體，側流免疫法捕獲HIV p24抗原，檢測限低至30 pg/mL。Wang等[23]發現順磁性探針標記的抗體與大于1 μm粒徑待測物的復合物在層析中沉積在某個特定位置，可通過直接測定沉積線處磁性進行定量，揭示了一種大粒徑待測物的磁性探針新方法。

1.5 近紅外有機小分子探針 由于有機小分子熒光染料的激發/發射波長通常在300～600 nm，往往與其自發熒光以及常見標本全血、血漿、血清和硝酸纖維素膜吸收譜重疊，帶來很高的信噪比，因此，有機小分子熒光染料在側流免疫法中較少應用。但是有機小分子染料作為信號探針也有其獨特的優勢，小分子鏈接生物大分子不會發生聚集，共價連接更快速、容易、可控、可定量；可采用更小孔徑的纖維素膜，側流速度更慢，從而可改善側流免疫法的分析性能。Swanson等[24]采用激發/發射波長在近紅外區的800 CW有機小分子染料(780 nm/800 nm)為近紅外信號探針，側流免疫法測定IL的線性范圍為0～200 pg/mL，揭示出近紅外有機小分子染料側流免疫法的優異分析性能和應用前景。

1.6 化學發光探針 化學發光常用的天然酶貯存條件苛刻，酶活性長期保存中易下降，通常需額外程序加入反應底物等試劑來實現測定[25]，這使得化學發光探針在側流免疫法中的應用受到限制。由于鉑納米熱穩定性高，易于長期保存，又具有過氧化物酶活性，是良好的人工模擬酶，Park等[26]將鉑納米作為探針標記抗體，夾心免疫側流法測定hCG,檢測限比膠體金下降了1 000倍，達到1 mIU/L。Joung等[27]以乙酰膽堿酯酶標記抗體作為捕獲抗體固定于測試線上，將辣根過氧化物酶(HRP)標記抗體固定于連接區和測試線之間，將魯米諾、化學發光底物增強劑和乙酰膽堿固定在連接區，在連接區與硝酸纖維素膜之間放置不對稱聚砜膜，隨著樣品中C反應蛋白(CRP)的層析，CRP先后與檢測抗體和捕獲抗體反應，連接區的底物等由于不對稱聚砜膜的延遲釋放，最后到達測試線和控制線處，通過乙酰膽堿酯酶水解乙酰膽堿原位產生過氧化氫，在增強劑催化下與魯米諾產生化學發光信號，CRP檢測限低至1 ng/mL，由于雙酶標記和不對稱膜的延遲釋放使得化學發光側流免疫法可一步完成。這些研究為側流免疫中高靈敏度的化學發光探針的長期貯存和自動化方面作出了有益的探索。

1.7 電化學探針 電化學法靈敏度高，背景低，易定量，易微型化，研究者不斷嘗試直接或將電活性物質通過脂質體等包封作為電化學探針，并用納米材料和酶標記等手段來增強電化學探針的靈敏度[28]。Du等[29]設計一個微型裝置，該裝置將切斷試紙條測試區、試紙條置放反應區、微型電化學測定整合在一起實現血標本中乙酰膽堿酯酶活性的測定，檢測限可低至0.02 nmol。Zhu等[30]將碳納米管紙電極(傳感面朝向硝酸纖維素膜)固定在競爭免疫法膠體金試紙條對照區作為工作電極，在以膠體金可視化檢測的同時，以計時電流法測定8-羥基脫氧鳥苷，檢測限可低至2.07 ng/mL，消除了與DNA片段相連的8-羥基脫氧鳥苷猝滅膠體金而使得可視化檢測結果偏低。然而生物體液標本中如抗壞血酸、堿性磷酸酶等使電化學探針應用帶來一定使用，Akanda等[31]以摻雜氧化銦電極為工作電極，以β-Gal、4-氨基-1-萘酚、三價六氨基釕、三(3-羰基乙基)膦之間發生快速的電化學-化學-化學氧化還原循環反應，側流免疫法檢測cTnI的檢測限達到0.1 pg/mL，由于循環伏安掃描電壓僅用到0.05 V，在避免了血清中堿性磷酸酶的干擾之外，還最小化了血清中電氧化性物質的干擾。然而，由于溶液在不同界面滲透強度不一致，可能導致電化學探針信號不穩定的研究較少[28]，應引起重視。

2 多組分檢測

在單個分析流程中同時實現兩個及以上組分檢測，可減少樣品消耗，節約時間成本，提高分析通量，降低整個分析的成本。空間分辨是側流免疫法多組分同時檢測的主要模式。采用同種探針標記兩種待測物、兩條檢測線來實現兩組分同時檢測的可視化[2]、鑭系摻雜熒光微球[32]、鑭系摻雜上轉換發光[33]、近紅外[24]等空間分辨側流免疫法已有報道。采用同類不同種探針標記兩種待測物、同一條檢測線來實現兩組分同時檢測的鑭系摻雜熒光微球[32]、量子點熒光[13]、表面增強拉曼散射[20]等光譜分辨模式的側流免疫法也有少量應用。雖然同時結合空間分辨和光譜分辨可能在同一條單條試紙條上實現兩種以上組分的檢驗[32]，然而采用共用樣品區而檢測區、對照區等可根據檢測需要設計成二維多通道等的策略來實現空間分辨更有優勢[34-35]。

3 展 望

近年來，隨著具有良好光、電、磁性質的納米粒子的涌現，研究者不斷探索可視化、熒光、散射等光學探針[36]、磁性探針、化學發光探針、電化學探針和有機小分子染料近紅外探針等為基礎的高靈敏度側流免疫法和多組分側流免疫法及兩種不同機制聯用[19,30]的側流免疫法，使得臨床檢驗中的側流免疫法朝著高靈敏度、多組分、簡便、快速和耐受方面快速發展，表明了側流免疫法在POCT和“4P”醫療模式中具有廣泛的應用前景。為更好地適應POCT的實際運用，化學發光和電化學探針中天然酶的替代，各種探針中抗體的替代，多組分檢測中探針的交叉干擾，探針的特異性及更高靈敏度探針的開發，便攜式探針檢測設備的進一步微型化和智能化，尤其是智能手機探針檢測軟件的開發和結合3D打印技術的探針適配設備的微型化、標準化[19,25,37]及其與醫院、患者診療數據等連接分析等[37-38]都將是未來的發展方向和研究重點。

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重慶市教委科學技術研究基金資助項目(KJ131804)。 作者簡介：肖忠華(1974-)，副教授，碩士，主要從事生物分析化學教學與研究。△

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