γ射線和紫外線應(yīng)用于血液制劑中病原體和白細胞的滅活

周煒鑫，郭天虹 綜述，黃遠帥 審校

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院輸血科,四川瀘州 646000)

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·綜 述· doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.28.042

γ射線和紫外線應(yīng)用于血液制劑中病原體和白細胞的滅活

周煒鑫，郭天虹 綜述，黃遠帥△審校

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院輸血科,四川瀘州 646000)

γ射線；紫外線；白細胞；血傳病原體；滅活

據(jù)2015年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)報道，全球每年采集的獻血量約為1.08億單位。通常，從獻血員的全血中可以分離出紅細胞、血小板和血漿等成分。紅細胞可以用于大量失血的患者，挽救其生命；血小板可以用于各種原因引起的血小板減少的患者；血漿里的凝血因子和血漿衍生蛋白質(zhì)可以用作血友病和先天免疫缺陷患者的替代治療；血漿里提取出來的免疫球蛋白通過靜脈或者肌肉注射，適用于免疫缺陷綜合征患者、藥物或者免疫抑制引起的免疫功能失調(diào)、免疫紊亂導致的血液疾病及炎性反應(yīng)，此外，還可以提供被動免疫及有效調(diào)節(jié)免疫缺陷患者的免疫應(yīng)答，是現(xiàn)在廣泛使用的生物制劑。由此可見，現(xiàn)代醫(yī)學中，血液制劑的輸注與患者息息相關(guān)，是不可或缺的支持療法。本文就輸血安全以及γ射線和紫外線在提高血液制劑安全性上的應(yīng)用進行綜述。

1 輸注血液制劑可能會引起的不良后果

伴隨著輸血而來的弊端在于輸血除了會引起發(fā)熱、過敏等不良輸血反應(yīng)，還可能會引起疾病的傳播。有報道稱，患者在使用了血漿衍生物-纖維蛋白粘合劑后感染了人類微小病毒B19[1]。而且血液本身的一些成分也會引起一些不良后果，例如當受血者輸注了含有殘留的獻血員白細胞的血液制劑后，會引起免疫相關(guān)的嚴重后果，包括非溶血性的發(fā)熱反應(yīng)、人類白細胞抗原(HLA)同種異體免疫反應(yīng)、輸血相關(guān)的移植物抗宿主疾病(transfusion-associated graft-versus-host disease,TA-GVHD)等[2]。血小板相關(guān)的細胞因子和白細胞相關(guān)的炎性因子IL-6、IL-8和TNF等則會引起非溶血性發(fā)熱反應(yīng)和過敏反應(yīng)。而血小板相關(guān)的細胞因子是主要原因，因為在用白細胞濾過器去除白細胞后，可以減少非溶血性發(fā)熱反應(yīng)的發(fā)生但并不能消除，而過敏反應(yīng)卻無變化[3]。因此，血液制劑的安全一直受到醫(yī)務(wù)人員和患者的高度重視。

隨著監(jiān)管力量的日益增強以及不斷出現(xiàn)的先進的篩選技術(shù)，大大降低了輸血引起的疾病傳播，比如病原體減少技術(shù)(pathogen reduction technology，PRT)可以減少輸血引起的疾病傳播，提高血液安全性，同時保證血液制劑結(jié)構(gòu)和功能的完整性[4]。然而，盡管病毒檢測技術(shù)的不斷提高，仍然不能避免輸血引起的窗口期疾病傳播，故輸血仍然存在風險。對于會引起不良后果的白細胞，有研究表明，25 Gy的γ輻照足以阻止T淋巴細胞的增殖，可以預防免疫功能低下的患者發(fā)生TA-GVHD[5]；白細胞濾過減少器處理的血液制劑要求每個輸注單位殘余的白細胞數(shù)低于5×106(美國)和 1×106(歐盟)，這2種方法處理血液制劑都可以減少但不能消除以上白細胞引起的相關(guān)不良免疫反應(yīng)。故為了能進一步提高血液制劑的安全性，需要更多更有效的方法應(yīng)用于去除血液制劑中的包括病原體、白細胞等給受血者帶來不良反應(yīng)的物質(zhì)。

2 需要保障血液制劑的安全性

能夠提高血液制劑安全性的理想方法應(yīng)該具備以下特點[6]：(1)可以滅活所有有包膜和無包膜的病毒；(2)對產(chǎn)品的生物活性無不良反應(yīng)，最小程度地減少生物制劑的成分丟失；(3)在適宜的條件下穩(wěn)定可靠，適用于大批量血漿制劑的流水線滅活；(4)不能添加一些后續(xù)步驟中必須去除的物質(zhì)；(5)應(yīng)當經(jīng)濟安全，可以廣泛應(yīng)用；(6)滅活步驟最好能夠在血液制劑保存的最終容器里進行；(7)該方法對產(chǎn)品沒有毒理學作用。目前，常用于滅活病原體和白細胞的方法有γ射線輻照、紫外線照射、白細胞濾過器過濾、碘液滅菌等，在滅活病原體或者白細胞上各有優(yōu)缺點。碘酒可用于滅活幾乎所有類型的病原微生物，包括細菌、病毒、寄生蟲等，是一種運用至今的消毒滅菌方法，可滅活血清、血漿或者血漿蛋白中有包膜和無包膜的病毒。但目前應(yīng)用最廣泛的是γ射線和紫外線照射。

2.1 γ射線輻照對病原體和血液成分的影響 γ射線是一種電磁波，是原子核能級躍遷蛻變時釋放出的射線，因此很小的劑量能通過相互作用擁有強大的穿透力。γ射線可以通過二次反應(yīng)產(chǎn)生自由基和活性氧來最大限度地滅活病原體。近半個世紀以前，就有學者報道γ射線能通過電離作用消除病原體核酸的活性和傳染性[7]；肖潔等[8]研究報道20～40 Gy的137Csγ射線能夠有效滅活單采血小板里的銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌和表皮葡萄球菌而不影響血小板的質(zhì)量；Miekka 等[6]報道稱，45 Gy的γ射線的劑量幾乎可以滅活所有包括無包膜病毒在內(nèi)的血源性傳播病毒。γ射線滅活病毒主要與劑量，病毒核酸大小及病毒的種類相關(guān)[9]。通常γ射線滅活細菌需要的劑量是20～25 Gy，而滅活病毒的劑量更大。盡管病毒的核酸大小遠遠小于細菌，但滅活病原體所需的γ射線的劑量與病原體的核酸體積大小成反比。因此，γ射線輻照常用于醫(yī)療設(shè)備、藥品、食品、培養(yǎng)專用血清等的消毒滅菌。與此同時，γ射線還能夠降低白細胞的活性，γ射線輻照處理血液制劑滅活白細胞來預防TA-GVHD已經(jīng)有40年[10]。

然而商業(yè)性的治療型生物制劑并未把γ射線輻照作為滅活病毒的常用方法，因為45～50 Gy的劑量在滅活病毒的同時也可能會破壞生物制劑的活性，比如血漿相關(guān)蛋白等。有研究表明γ射線破壞蛋白質(zhì)有2個機制：(1)可以直接作用于目標蛋白的共價鍵，通過光子聚集的能量來破壞這個蛋白分子；(2)間接與水分子作用產(chǎn)生自由基和活性氧來破壞99.9%的蛋白質(zhì)[11]。間接作用包括：在有氧條件下，γ射線作用于水溶液會產(chǎn)生水合電子、氫原子、過氧化氫及最具殺傷力的羥基自由基等，均可導致蛋白質(zhì)發(fā)生物理和化學方面的改變，比如蛋白質(zhì)側(cè)鏈氧化、蛋白鏈分離和破碎、交聯(lián)、解鏈、形成新的反應(yīng)基團，包括疏水性氨基、?；鶜埢趸纬傻牧u基和過氧化氫衍生物，蛋白質(zhì)羧基化產(chǎn)物，二聚酪氨酸等許多新的基團。這一系列反應(yīng)破壞了蛋白質(zhì)的完整性，導致蛋白質(zhì)喪失了生物活性[12]。

盡管理論上如此，但在實踐過程中有學者發(fā)現(xiàn)，在某些條件下，殺病毒劑量的γ射線并沒有對相關(guān)蛋白產(chǎn)生明顯的影響。在Tran 等[13]的研究中，對于用殺病毒劑量(45 Gy)的γ射線輻照靜脈注射的免疫球蛋白(intravenous immunoglobulins，IVIG)后，發(fā)現(xiàn)其Fab和Fc段的結(jié)構(gòu)域保持輻照前的完整性，故推薦使用γ射線來處理IVIG提高其安全性。Smeltzer 等[14]用不同劑量γ射線對IgG進行照射，通過SDS-PAGE、HPLC、ELISA等方法來檢測IgG的抗原結(jié)合能力和Fc段結(jié)合能力，以此來探究γ射線對IgG結(jié)構(gòu)和功能的影響。結(jié)果顯示，在-80 ℃時，殺病毒劑量50 Gy 射線的照射下，免疫球蛋白多肽鏈的完整性和二級結(jié)構(gòu)不被破壞，三級結(jié)構(gòu)構(gòu)象發(fā)生了變化但不足以影響免疫球蛋白功能活性，并且對最重要的結(jié)構(gòu)區(qū)域的構(gòu)象完整性無影響，因為對比輻照和未輻照的IVIG的熵值大小接近，故證明在輻照下蛋白質(zhì)并未發(fā)生明顯的內(nèi)部反應(yīng)。所以，盡管γ射線對蛋白質(zhì)分子的熱穩(wěn)定性產(chǎn)生了輕微的影響，但是并沒有改變IgG的本質(zhì)。進一步研究還發(fā)現(xiàn)，γ射線對IgG完整性的影響小于pH的變化對IgG完整性的影響。Grieb 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，porcine parvo-virus(PPV)是最耐受γ輻照的無包膜病毒，用45 Gy的劑量輻照混入PPV病毒的單克隆抗體，當抗壞血酸鈉和自由基清除劑加入后或者將單克隆抗體凍干后輻照，都可以使PPV數(shù)量減少1×105個，并且保護單克隆抗體的功能活性和主要結(jié)構(gòu)的完整性。當劑量增加至50 Gy時，可以滅活1×1010個的PPV，而單克隆抗體跟抗原結(jié)合的活性可以得到超出97%的恢復。因此，他們認為，在殺病毒劑量的γ輻照過程中，加入抗氧化劑或者自由基清除劑，或者在冰凍固體狀態(tài)下輻照可以很好地保護生物制劑有效成分的活性。

除了對血漿蛋白的影響，γ射線對紅細胞和凝血因子等也有一定的影響。γ射線會改變紅細胞的形態(tài)、電解質(zhì)濃度等。Xu 等[16]研究了不同劑量的γ射線對紅細胞超微結(jié)構(gòu)的影響，以及輻照后紅細胞儲存不同時間下的電解質(zhì)和pH的變化。結(jié)果顯示隨著劑量的增加，出現(xiàn)異常形態(tài)紅細胞(棘形紅細胞，退化紅細胞等)的比例逐漸增加；輻照對Na+、K+、Cl-水平有影響，且對K+的影響最大，因為輻照可能會改變細胞的滲透壓和膜通透性，隨著劑量增大，電解質(zhì)水平改變更加明顯。而pH的下降與γ射線劑量和紅細胞儲存時間相關(guān)。Sarkar 等[17]研究了γ射線與凝血因子之間的聯(lián)系，他們用30 Gy劑量的γ射線輻照新鮮冰凍血漿后，通過檢測PT、APTT、TT、vWFAg、FⅡ、FV、FⅧ、FIX、FX、FXI、FⅫ、C蛋白、S蛋白、D-二聚體等的變化，探討γ射線對新鮮冰凍血漿凝血和抗凝功能的影響。結(jié)果顯示，30 Gy的γ射線輻照后，縮短了PT、APTT、TT，激活了FIX、FX、FXI、FXII。但是這些變化都很微小，無重要的臨床意義。而對抗凝系統(tǒng)(C蛋白、S蛋白活性)和纖溶系統(tǒng)也無影響。該研究結(jié)果與Weisbach 等[18]的研究相符。由此可見，γ射線可以用于血漿及其血漿衍生蛋白制品和紅細胞制劑的病原體和殘留白細胞的滅活。

2.2 紫外線照射對病原體和血液成分的影響 近年來，有學者提倡用紫外線來替代γ射線。因為與光化學、光動力學滅菌法相比較，紫外線具有明顯的優(yōu)勢，它本身具有活性，不需要加入可能會封閉蛋白質(zhì)以致產(chǎn)生有害免疫反應(yīng)[19]的光敏化合物，因此，也不需要去除光敏化合物及它的代謝產(chǎn)物。一般來講，最常使用的是短波(UVB，200～280 nm)和中波紫外線(UVB,200～280 nm)。UVC和UVB滅活病原體的原理在于，可以作用于病毒的核苷酸使之形成環(huán)丁烷嘧啶和嘧啶二聚體，從而阻止病毒核酸的復制延長，達到滅活病毒的作用[20]。Mohr 等[21]研究結(jié)果表明，通過比較1 J/cm2UVC和2 J/cm2的UVB照射對血漿功能的影響，得出UVC更加適合血漿的滅菌；DNA病毒比RNA病毒、單鏈核酸病毒比雙鏈核酸病毒對紫外線敏感。用1 J/cm2UVC照射含病毒[水皰性口炎病毒(VSV)、單純皰疹病毒(SHV-1)、腦心肌炎病毒(EMCV)、豬細小病毒(PPV)和艾滋病病毒(HIV)等]的血漿后，除HIV以外，所有病毒都被滅活了，同時凝血因子和血漿蛋白的損失不超過10%～20%。Fast 等[10]報道稱，核黃素(維生素B2)聯(lián)合紫外線輻照可以通過不可逆地改變核酸，來滅活大部分的病原體及抑制由白細胞引起的一系列諸如移植物抗宿主反應(yīng)，同種異體免疫等有害的免疫反應(yīng)。此外，核黃素(維生素B2)聯(lián)合紫外線輻照還可以減少有包膜和無包膜的病毒，以及與臨床相關(guān)的污染菌[4]。重要的是，這種方法處理新鮮冰凍血漿后對蛋白質(zhì)和凝血因子Ⅷ的活性無影響[22]。因此，紫外線照射可以用于血液制劑的病原體滅活。

2.3 γ射線輻照和紫外線照射對白細胞功能的影響 此外，γ射線和紫外線都可以作用于白細胞，減低它的活性，有學者對比研究了這兩種方法對白細胞的不同影響。Fast 等[10]研究了全血用核黃素(維生素B2)聯(lián)合紫外線和單獨用γ射線分別處理后，通過體內(nèi)和體外實驗來對比2種方法對白細胞活性和功能的影響。體外實驗表明，核黃素(維生素B2)聯(lián)合紫外線照射可以抑制同種免疫反應(yīng)及讓白細胞失去抗原提呈的能力；相反，γ射線輻照不具有此作用。2種方法都可以阻止淋巴細胞的增殖。γ射線輻照后分泌的細胞因子濃度(TNF-α、IL-10、IL-6、IL-1β、IL-8)與未作處理組比較并未發(fā)現(xiàn)明顯差異，而核黃素(維生素B2)聯(lián)合紫外線處理后，可以影響細胞因子的合成從而使大部分的細胞因子(除TNF-α、IL-8外)分泌減少。體內(nèi)實驗包括從核黃素(維生素B2)聯(lián)合紫外線、γ射線(25 Gy)處理的血液和不作處理的血液中分離出白細胞注射到小鼠體內(nèi)，觀察他們發(fā)生GVHD的發(fā)展情況，結(jié)果這2種方法處理過的白細胞輸注后都未引起小鼠的GVHD。因此，他們推薦用核黃素(維生素B2)聯(lián)合紫外線照射來替代γ射線輻照處理血液來提高成本效益。Reddy等[23]作了一個體內(nèi)體外實驗，結(jié)果表明，核黃素(維生素B2)紫外線照射與γ輻照(25 Gy)相比，對于滅活白細胞預防GVHD的能力是相同的，但更加有效地減少細胞因子生成和同種免疫反應(yīng)，該結(jié)果與Fast 等[10]的實驗結(jié)果相符。最近，Pohler 等[2]的研究也證實了γ射線輻照和紫外線這兩種方法對于預防GVHD具有同樣的效果，而在抑制T細胞增殖、細胞因子分泌和抗原提呈能力方面，紫外線優(yōu)于γ射線輻照。因此紫外線照射作為替代γ射線輻照的一種方法，應(yīng)用于滅活血液制劑中殘留的白細胞來預防GVHD。

3 展 望

由此可見，γ射線和紫外線滅活病原體和白細胞的機制和影響都有不同之處。γ射線殺病原體有直接和間接作用，直接作用是射線與核酸的相互作用，導致核酸鏈的交聯(lián)和斷裂。間接作用是與細胞內(nèi)外的環(huán)境，如與水發(fā)生作用產(chǎn)生自由基、羥自由基和氫原子等[24]。紫外線(254 nm)可以直接作用于核酸，導致嘧啶二聚體的產(chǎn)生，從而阻止核酸轉(zhuǎn)錄的延長。當加入核黃素后，在紫外光照射下，可以特異性地在核酸的鳥嘌呤堿基處對DNA造成損傷，從而使核酸骨架鏈斷裂，滅活病原體[25]。γ射線和紫外線都可以滅活白細胞預防GVHD，但在抑制T細胞增殖、細胞因子分泌和抗原提呈能力方面，紫外線優(yōu)于γ射線輻照。不足之處在于，兩種方法處理血液制劑可能會破壞生物制劑的有效成分。γ射線與水分子作用產(chǎn)生自由基和活性氧破壞蛋白質(zhì)，紫外線通過氧化芳香族氨基酸，打開肽鏈之間的二硫鍵來破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。但對于γ射線，加入抗氧化劑或自由基清除劑，或者在冰凍固體狀態(tài)下輻照可以很好地保護生物制劑的有效成分活性。總之，臨床工作中，應(yīng)當根據(jù)不同目的來選取不同的方法，同時不斷創(chuàng)新改進現(xiàn)有方法，盡可能地保證血液制劑的質(zhì)量。

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四川省衛(wèi)生廳科研基金資助項目(120336)；西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院自然科學基金項目(15048)。 作者簡介:周煒鑫(1990-)， 在讀碩士，主要從事自體輸血、輸血安全研究?！?/p>

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