佐劑在肺炎鏈球菌疫苗免疫中的作用*

張　靜 綜述，崔亞利，江詠梅 審校

(四川大學華西第二醫院檢驗科,成都 610041)

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·綜述·

佐劑在肺炎鏈球菌疫苗免疫中的作用*

張靜 綜述，崔亞利，江詠梅△審校

(四川大學華西第二醫院檢驗科,成都 610041)

霍亂毒素；肺炎鏈球菌疫苗；佐劑

肺炎鏈球菌是引起各年齡組高發病率和病死率的主要病原菌，其疫苗的研制和使用對肺炎鏈球菌感染的防治具有重要意義。但目前臨床能投入使用的疫苗卻較少，主要有23價多糖疫苗和7、10、13價多糖蛋白結合疫苗，原因之一是缺乏能用于人體的高效的免疫佐劑。肺炎鏈球菌疫苗常用的佐劑主要有：霍亂毒素(cholera entero toxin,CT)、大腸桿菌不耐熱腸毒素(heat-labile enterotoxin LT)、乳酸乳球菌(lactococcus lactis)、DNA疫苗佐劑、鋁劑等。本文對肺炎鏈球菌疫苗中常用的幾種佐劑的免疫效應進行了綜述，為肺炎鏈球菌疫苗及免疫佐劑的臨床應用和進一步研制提供參考資料。

1　常用肺炎鏈球菌疫苗佐劑及作用機制

1.1CTCT是霍亂弧菌分泌的一種不耐熱腸毒素，由1個A 亞單位和5個B 亞單位構成[1]。A亞單位為毒性單位，可引起機體腹瀉，包含A1和A2兩種肽鏈，A1 肽鏈具有腺苷二磷酸(ADP)核糖基轉移酶活性，能催化腸道上皮細胞表面環磷酸腺苷復合物中三磷酸鳥苷(GTP)結合蛋白腺苷二磷酸核糖化反應。A2肽鏈則通過與B 亞單位結合參與受體介導的內吞作用中的轉位作用。B 亞單位能特異性地同時與真核生物腸上皮細胞的5個神經節苷脂神經節苷脂1(GM1)結合[2]，它們之間的這種交互作用可增強機體對疾病的感應。已有學者提出CTB可有效增強自身免疫病及過敏性疾病的治療效果[3]。CTB與抗原共同經鼻或口服免疫，不僅誘導局部黏膜發生免疫反應，同時遠隔部位其他黏膜也可產生。其免疫反應的機制可能如下：(1)誘導腸黏膜離子通道和載體的表達，增加分泌黏蛋白的表達[4]，也可通過改變抗原的物理性狀和增加腸黏膜通透性來增加抗原的攝入量。(2)增強抗原遞呈細胞(如樹突狀細胞、吞噬細胞、B淋巴細胞)呈遞抗原的能力[5]。(3)增強細胞因子如白細胞介素(IL)-4、IL-5、IL-10，而非IL-2、IL-12、干擾素γ(IFN-γ)的產生及誘導以Th17為主的免疫反應[6]，也可通過激活腸黏膜淋巴細胞核因子κB(NF-κB)通路增強免疫效應[7]。(4)誘導產生抗炎反應，促進Th2型反應，抑制Th1型反應，增強IgA的產生。(5)調節黏膜相關淋巴組織T調節細胞(Treg)生長環境。

CT作為免疫佐劑主要有兩種使用方式：一種是與抗原形成嵌合或融合蛋白進行免疫，另一種是與抗原簡單的混合共同免疫，這兩種方法對免疫效應的影響是不同的。目前肺炎鏈球菌候選疫苗蛋白，如肺炎鏈球菌表面蛋白A(PsaA)與CTB融合，形成融合蛋白，融合的PsaA-CTB免疫原性遠遠高于單獨的PsaA或CTB，經鼻或經口免疫可誘導系統的及局部的免疫反應，誘導產生大量IgG和IgA，其中由Th2型免疫反應介導的抗體亞型IgG1、IgG2a滴度最高。雖然CT已廣泛用于動物實驗，但因其具有強毒性，在人體的使用仍受到限制，目前，已有研究通過對CTA區域進行肽鏈融合及對CT的活性中心進行定點誘變來減弱CT的毒性[3]。

1.2LTLT由產毒性大腸桿菌產生，其三維結構與CT極為相似，由1個A亞單位和5個B亞單位組成，A亞單位具有ADP核糖基轉移酶活性，B亞單位則可與細胞結合[8]。根據基因、生化、免疫學方面的差異，可將LT分為LTⅠ和LTⅡ，通常所說的LT 一般是指Ⅰ型大腸桿菌不耐熱腸毒素，而LT Ⅱ與人類疾病無關，在自然界很少見。LT通過腸道黏液的分泌來激活A亞單位，誘導機體產生較強的體液和細胞免疫反應。LTA 是LTⅠ的毒性亞基，可引起機體發生水性腹瀉。目前，有些研究者通過突變LT中的某些氨基酸位點，去除毒性而保留其作為佐劑的免疫原性。LTB 無毒性且具有良好的黏膜佐劑活性，可作為黏膜免疫的佐劑。LTB通過與免疫細胞表面的受體結合而發揮作用。目前，LT作為佐劑已可通過黏膜(滴鼻、舌下、口服、直腸)、局部外用(經皮)、腸外(皮下、皮內)等免疫途徑與免疫原共同用于機體免疫。LT可能通過調節一些細胞因子的水平，如 IFN-γ、IL-4、IL-10等來增強免疫效應。

1.3乳酸乳球菌乳酸乳球菌是一種革蘭陽性菌，在發酵及食品保存中廣泛應用，被美國食品與藥品管理局(food and drug administration,FDA)認證為安全級微生物(generally regarded as safe,GRAS)。乳酸乳球菌基本不在胃腸道內定植，不會危害腸道內正常益生菌群和造成基因污染，并可避免長期定植帶來的耐受[9]。活的或滅活的乳酸乳球菌都是較好的疫苗載體[10]，能誘導特定人群如嬰幼兒、老年人、免疫抑制人群產生有效的免疫反應。乳酸乳球菌本身分泌蛋白較少，可減少載體微生物自身蛋白對外源分泌蛋白的干擾，不產生任何胞外蛋白酶，不會引起抗原蛋白降解，表達的重組蛋白不需純化[11]。乳酸乳球菌可激活Toll樣受體，能刺激、活化免疫細胞，進而增強抗原特異性免疫反應[12]。重組乳酸乳球菌已成功用于表達多種異種抗原，可作為多種病原菌及病毒的佐劑[13]。目前，對乳酸乳球菌在各種疫苗中的應用研究已取得了一定成果，但僅限于臨床前期研究階段，對乳酸乳球菌特性、增強抗原免疫原性、產生免疫應答的機制仍需進一步探索。

肺炎鏈球菌候選疫苗蛋白，如PspA[14]、肺炎鏈球菌保護蛋白(PppA)與活的或滅活的乳酸菌經黏膜或經口免疫小鼠[13]，都可誘導小鼠產生系統的、局部的免疫反應，其免疫效應高于用鋁劑作為佐劑的效應。但由于重組乳酸菌表達的抗原不同，誘導產生的抗體類型也有所不同。

1.4DNA疫苗佐劑鳥嘌呤核苷酸(CpG) DNA序列由胞嘧啶核苷酸和CpG為基序組成，在DNA疫苗載體骨架中導入該基序，能夠快速活化T、B細胞，誘導產生Th1型細胞因子及多價IgM，增強主要組織相容性復合體(MHC)Ⅱ類分子、CD40、細胞間黏附分子(ICAM)的表達，并能促進抗原遞呈細胞的增殖與成熟。用肺炎鏈球菌候選疫苗蛋白PspA與Flt3配體(pFL)和CpG寡脫氧核苷酸(ODN)聯合免疫2歲齡的小鼠，可誘導產生與幼鼠相似的免疫反應，主要是Th1、Th2型反應，并可誘導小鼠上呼吸道的成熟DCs[15]。并且在鼻黏膜相關淋巴組織(NALT)、頸部淋巴結(CLNs)表面可檢測到表達MHC Ⅱ、CD40、CD80、CD86等黏附分子的CD11b+、CD8+、 B220+DCs。pFL誘導的CD8+DC對Th2型細胞因子介導的抗原特異性免疫反應具有重要作用。CpG ODN通過激活類漿細胞樣樹突狀細胞表面的Toll樣受體9(TLR9)，進一步介導B淋巴細胞的激活[16]，TLR9介導的免疫反應在免疫應答過程中具有重要作用，CpG DNA疫苗佐劑可有效地誘導產生抗原特異性免疫反應，是一種高效的黏膜免疫佐劑[17]。

1.5鋁鹽佐劑鋁鹽佐劑從19世紀30年代開始已廣泛用于疫苗中，且是美國惟一批準的可用于臨床的疫苗佐劑。鋁鹽佐劑能輔助疫苗快速地誘導機體產生免疫反應，增強細胞因子如IL-1β的分泌。但是一些研究者認為炎癥因子并不參與鋁鹽佐劑誘導的機體免疫反應[18]。鋁劑與抗原共同免疫能誘導機體產生持續的、高濃度的IgG抗體[19]。由于鋁劑對機體的生物反應性，它也可作為有效的過敏性免疫治療的佐劑。盡管鋁劑已用于臨床多年，但其誘導機體產生免疫反應的機制仍然不清楚。

2　其他肺炎鏈球菌疫苗佐劑

肺炎鏈球菌疫苗候選蛋白除與上述幾種常用佐劑可共同作用發揮免疫保護作用外，還可與如細菌鞭毛蛋白(vibrio vulnificus flagellin,FlaB)、納米凝膠(nanogel，consisting of a cationic cholesteryl group-bearing pullulan,cCHP)、IL-12等共同免疫而增強機體的免疫效應。

2.1FlaBFlaB在細菌體內高度表達且生物學功能穩定，作為疫苗及免疫治療的佐劑對黏膜具有很強的免疫刺激作用。FlaB是TLR5 的配體，是種類有限的受體激動劑之一，可直接結合表達TLR5的免疫細胞，激活NF-κB途徑，促進細胞因子的分泌。將FlaB與PspA融合組成重組蛋白：FlaB-PspA 和 PspA-FlaB，分別免疫小鼠，結果顯示FlaB-PspA組小鼠存活率較高，并有大量的IL-4產生，但兩組小鼠的IFN-γ水平無差別，并且IgG1滴度高，IgG2a滴度低，這都表明FlaB刺激機體主要產生Th2型反應[20]。

2.2cCHPcCHP是一種納米凝膠制劑，用重組的cCHP-PspA免疫小鼠可抵抗肺炎鏈球菌致死性感染，減少肺炎鏈球菌在宿主上下呼吸道黏膜的定植及侵襲，增強細菌在支氣管黏膜及肺部的清除，誘導機體系統的及局部的黏膜免疫反應[21]。研究表明cCHP-PspA經鼻黏膜免疫，是一種有效、安全的免疫方式，不會引起嗅球及中樞神經系統受損[22]。主要誘導黏膜產生強烈的Th2 和Th17型免疫反應，產生大量的IL-4 和 IL-13等細胞因子。

2.3IL-12IL-12是一種調節性細胞因子，可誘導CD4+T、CD8+T細胞產生免疫反應，刺激Th1和NK細胞產生IFN-γ、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等細胞因子，也可增強固有免疫反應，促進感染部位中性粒細胞的聚集[23]。肺炎鏈球菌的清除主要通過調理吞噬作用，用IL-12作佐劑經鼻黏膜免疫小鼠可誘導機體產生系統的、局部的免疫反應，其中IgM、IgG2a的滴度較高，而IgG1的滴度與不加佐劑組相比無差異，IgG3在無佐劑組則不能檢測到。IL-12作佐劑可減少肺炎鏈球菌在鼻咽部的定植，曾有文獻報道，IL-12作為PPS疫苗佐劑經皮下免疫具有顯著的毒性作用，但是也有其他研究表明IL-12經鼻黏膜免疫與經注射途徑給藥相比所產生的毒性作用較小。

3　展　　望

同種類的疫苗選擇不同的免疫佐劑對免疫效應的影響不同。開發研制新型的免疫佐劑以增強疫苗的免疫效力并減少疫苗的毒副作用將是未來的發展趨勢。相信隨著分子生物學和免疫學理論與技術的發展，對相關載體和佐劑的研究將極大地推動其在免疫中的應用。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2016.25.037

國家自然科學基金青年科學基金(81301399)。

張靜(1989-)，在讀碩士，主要從事肺炎鏈球菌致病機制及蛋白疫苗研發的分子生物學研究。

,E-mail:jiangyongmei-1@163.com。

R446

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1671-8348(2016)25-3565-03

2016-03-18

2016-05-15)