普伐他汀對人胰腺癌細胞SW1990增殖的抑制作用及其機制

張敏，孔雁，姜達

(1邢臺市人民醫院，河北邢臺054001；2河北醫科大學附屬第四醫院)

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普伐他汀對人胰腺癌細胞SW1990增殖的抑制作用及其機制

張敏1，孔雁2，姜達2

(1邢臺市人民醫院，河北邢臺054001；2河北醫科大學附屬第四醫院)

摘要：目的探討普伐他汀對人胰腺癌細胞SW1990增殖的抑制作用及其機制。方法 分別用含普伐他汀0、1、5、10、15、20、25、50 μmol/L的RPMI1640培養基培養人胰腺癌細胞SW1990，24、48、72、96 h后采用MTT比色法檢測細胞抑制率，以觀察普伐他汀對SW1990細胞增殖的影響。48 h后采用流式細胞儀測定細胞周期分布并測算細胞增殖指數(PI)，以觀察0、5、10、20 μmol/L普伐他汀對SW1990細胞周期分布和凋亡的影響，光學顯微鏡下觀察細胞形態學改變，流式細胞儀及間接免疫熒光技術分析普伐他汀作用后SW1990細胞p21Ras、細胞周期蛋白激酶4(CDK4)、Bax蛋白表達的變化。結果普伐他汀(1、5、10、15、20、25、50 μmol/L)對SW1990細胞具有抑制增殖的作用，有明顯的劑量-效應和時間-效應依賴關系(P均<0.05)。普伐他汀作用SW1990細胞后，有明顯的細胞形態學改變。0、5、10、20 μmol/L普伐他汀作用SW1990細胞48 h后，隨藥物濃度增大, G0/G1期細胞逐漸增多; S期和G2/M期細胞則逐漸減少(P均<0.05)。0、5、10、20 μmol/L普伐他汀處理細胞48 h后，出現典型的亞二倍體凋亡峰，依普伐他汀濃度增大而逐漸升高；細胞凋亡率分別為1.06%、6.24%、12.46%、17.21%。0、5、10、20 μmol/L普伐他汀處理SW1990細胞48 h后，p21Ras、CDK4的熒光指數FI值隨處理濃度增大而逐漸降低；Bax的FI值則隨處理濃度增大而逐漸升高(P均<0.05)。結論 普伐他汀可通過下調p21Ras、CDK4蛋白的表達和上調Bax蛋白的表達而發揮其抑制胰腺癌細胞SW1990增殖、誘導該細胞凋亡的作用。

關鍵詞：胰島腫瘤;普伐他汀;細胞增殖;細胞凋亡;SW1990

胰腺癌是消化道常見的惡性腫瘤[1]。其起病隱襲，缺乏特異癥狀和體征，惡性度極高。他汀類藥物是內源性膽固醇合成的限速酶-羥甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的競爭性抑制劑，能有效抑制膽固醇合成及阻礙甲羥戊酸(MVA)途徑，臨床普遍用于治療和預防高脂血癥和其他心血管事件。近年研究發現，他汀類藥物能抑制多種腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡。2011年12月~2013年12月，本實驗通過研究普伐他汀對SW1990細胞的體外作用及其相關機制，旨在為臨床治療胰腺癌提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料細胞系及細胞培養：人胰腺癌細胞株SW1990購自中國科學院上海細胞所。將SW1990細胞培養于含體積分數為10%胎牛血清的RPMI 1640培養基(含青霉素100 U/mL,鏈霉素100 U/mL)中，置于37 ℃、飽和濕度、5% CO2的培養箱內常規傳代培養。取對數生長期細胞，經處理后調整適宜細胞濃度，以臺酚藍測定細胞活力在95%以上備用。普伐他汀為中國藥品生物制品鑒定所產品，將普伐他汀標準品用無水乙醇溶解，加0.1 mol/L的NaOH激活，水浴滴定后，配制成1 mmol/L。MTT溶液用pH值7.4的0.1 mol/L的PBS配制成5 mg/mL，分裝保存。鼠抗人單克隆抗體p21Ras、鼠抗人單克隆抗體細胞周期蛋白激酶4(CDK4)、鼠抗人單克隆抗體Bax均為美國Santa Cruz Biotechnology公司產品。

1.3SW1990細胞形態學觀察將SW1990細胞以4×105/瓶接種于25 mL培養瓶中，待細胞貼壁后, 用含普伐他汀0、5、10、20 μmol/L的RPMI1640培養基換液,繼續培養24～72 h，分別于不同時相點在倒置顯微鏡下觀察細胞形態，并隨機拍照。

2結果

2.1不同濃度普伐他汀不同時間對SW1990細胞增殖的影響見表1。

表1　不同濃度普伐他汀不同時間對SW1990細胞增殖的影響±s)

注：與0 μmol/L普伐他汀比較，*P<0.05 ,**P<0.01。

2.2細胞形態學觀察結果光學顯微鏡下可見，未加普伐他汀組細胞數目較多，形態規則，呈長條形貼壁生長。在普伐他汀作用下，SW1990細胞縮小呈紡錘狀，兩端各有一細長的偽足。隨普伐他汀濃度增大和作用時間延長，這種變化逐漸明顯，SW1990細胞漸變圓，貼壁細胞減少，脫落細胞增多。同時，可見到細胞凋亡的形態學改變：細胞皺縮、破裂呈不規則形，在細胞周圍有放射狀分布的點片狀細胞碎片，有的細胞質中出現空泡。隨藥物濃度增加和作用時間延長，細胞破碎增多，培養基中可見到大量細胞碎片。

2.3不同濃度普伐他汀對SW1990細胞周期分布和凋亡的影響不同濃度普伐他汀對SW1990細胞周期分布的影響見表2。SW1990細胞經不同濃度普伐他汀處理48 h后，流式細胞儀測得典型的亞二倍體凋亡峰,隨普伐他汀濃度增大而逐漸升高; 0、5、10、20 μmol/L普伐他汀處理SW1990細胞48 h后，凋亡率分別為1.06%、6.24%、12.46%、17.21%。

表2　不同濃度普伐他汀對SW1990細胞周期

注：與0 μmol/L普伐他汀比較，*P<0.05 ,**P<0.01。

2.4不同濃度普伐他汀對SW1990細胞p21Ras、CDK4、Bax蛋白表達的影響見表3。

表3　不同濃度普伐他汀對SW1990細胞p21Ras、

注：與0 μmol/L普伐他汀比較，*P<0.05 ,**P<0.01。

3討論

近年研究發現，他汀類藥物具有抑制腫瘤細胞增殖[2，3]、抑制VEGF表達從而具有抗腫瘤血管生成[4]、誘導腫瘤細胞分化和凋亡、降低腫瘤細胞侵襲與轉移能力[5]及放化療增敏、逆轉耐藥[6]等作用。他汀類藥物在胰腺癌的作用日益受到重視，一些臨床研究也證實他汀類藥物能延長可切除胰腺癌患者的生存期[7]、降低胰腺癌的患病風險[8]、協同進展期胰腺癌化療增敏作用。

Ras是20世紀80年代發現的第一個癌基因，廣泛存在于動物和酵母細胞中。Bos等認為Ras和腫瘤的發生及腫瘤細胞的異常增殖相關。國外研究發現，應用他汀類藥物后膜結合的Ras蛋白減少，而胞質中的Ras蛋白含量增加[9]。楊士杰等報道，辛伐他汀能阻滯p21Ras蛋白錨定于肝癌細胞SMMC-7721的細胞膜上，使膜表面的p21Ras蛋白水平下降。本實驗中, 普伐他汀作用SW1990細胞后, 具有抑制SW1990細胞增殖及誘導該細胞凋亡的作用，此作用隨藥物濃度增加和處理時間延長而增強。流式細胞技術檢測發現, 隨普伐他汀抗增殖作用和誘導凋亡作用的增強，SW1990細胞膜表面p21Ras蛋白水平進行性下降。說明他汀類藥物能通過靶向抑制HMG-CoA還原酶及MVA途徑，干擾Ras蛋白的膜定位從而阻滯Ras功能的正常發揮，產生抑制腫瘤細胞增殖并誘導其凋亡的作用。

細胞周期調控機制涉及細胞周期蛋白(cyclins)、細胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)及細胞周期依賴性激酶抑制劑(CKIs)等。細胞周期調控的核心是cyclins和CDKs結合形成的絲/蘇氨酸蛋白激酶復合體的激活。大量研究顯示，他汀類藥物能阻滯多種腫瘤細胞周期進程于G1期，同時伴有cyclins、CDKs的表達降低，CKIs p21和p27水平升高。在本實驗中，我們發現普伐他汀可阻滯SW1990細胞于G1期，同時引起細胞內CDK4蛋白表達以一種劑量依賴性方式下降。推測普伐他汀作用SW1990細胞后，CDK4表達降低，某些p21家族和(或)p16家族的CDIs制劑水平升高，與CDK4-cyclinD結合增強，抑制其活性，阻止pRb蛋白磷酸化，從而阻滯細胞周期于G1期，介導了SW1990細胞的增殖受抑和凋亡發生。

近年來，細胞凋亡與腫瘤的關系逐漸得到人們的認識和重視。Bcl-2家族是目前最重要的調控細胞凋亡的基因家族，其成員可分為兩大類：凋亡抑制基因(Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1等)和促凋亡基因(Bax、Bad、Bak等)。Bcl-2是重要的抑制腫瘤細胞凋亡的基因，而Bax和Bcl-2的作用相反。一般認為Bax基因和 Bcl-2基因兩者表達水平之間的平衡與否，決定了細胞是否凋亡。許多研究者認為他汀類藥物通過上調Bax基因表達和下調Bcl-2基因表達，介導了多種腫瘤細胞的線粒體凋亡通路。本實驗結果發現，普伐他汀可誘導SW1990細胞發生凋亡, 該作用呈劑量依賴關系。0、5、10、20 μmol/L普伐他汀作用細胞48 h后，隨著濃度增加，Bax表達上調, 推測Bax基因的過表達是普伐他汀誘發SW1990細胞凋亡的機制之一。

總之，普伐他汀可通過下調p21Ras、CDK4蛋白的表達和上調Bax蛋白的表達而發揮其抑制胰腺癌細胞SW1990增殖、誘導該細胞凋亡的作用。

參考文獻：

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(收稿日期：2015-05-21)

中圖分類號：R736.7

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)01-0030-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.01.010