玉米單倍體技術(shù)的利用研究與發(fā)展前景

宋俏姮，楊躍華，孔亮亮，劉俊峰

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所，四川德陽(yáng) 618000)

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玉米單倍體技術(shù)的利用研究與發(fā)展前景

宋俏姮，楊躍華，孔亮亮，劉俊峰

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所，四川德陽(yáng) 618000)

摘要闡述了單倍體誘導(dǎo)技術(shù)在玉米育種中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)、單倍體的誘導(dǎo)機(jī)理和遺傳規(guī)律、玉米單倍體育種技術(shù)的必要環(huán)節(jié)以及國(guó)內(nèi)的利用現(xiàn)狀，同時(shí)討論了目前單倍體技術(shù)應(yīng)用的局限性和困難，并展望了該技術(shù)在鮮食玉米育種中利用的可能。

關(guān)鍵詞玉米；單倍體技術(shù)；誘導(dǎo)育種；發(fā)展前景

我國(guó)是全球第二大玉米生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，玉米產(chǎn)量和品質(zhì)的提高需要不斷改良發(fā)展育種手段。選育高產(chǎn)、高抗、高配合力的自交系是玉米育種中的基礎(chǔ)和核心環(huán)節(jié)。單倍體育種是指利用植物單性生殖的方法，使其形成單倍體后通過自然或人為的方式對(duì)其染色體進(jìn)行加倍，成為純合二倍體(即純系)，再?gòu)闹羞x育新品種(系)的方法。單倍體誘導(dǎo)育種與常規(guī)育種手段相比具有明顯優(yōu)勢(shì)：①它通過控制雜種分離，2個(gè)世代便可得到純合二倍體，加快了自交系的選育，顯著縮短了育種周期；②由于單倍體形成的二倍體是高度純合的，沒有顯性性狀的掩蓋，通過植株就能直觀地對(duì)隱性性狀進(jìn)行篩選，從而降低誤選率，有效提高育種效率和節(jié)約育種成本；③能夠與其他育種手段相結(jié)合，克服遠(yuǎn)緣雜交育種的不育，提高誘變育種的效率，形成的純合二倍體可作為分子標(biāo)記輔助育種和轉(zhuǎn)基因育種的優(yōu)良材料。因此，弄清單倍體的誘導(dǎo)機(jī)理和遺傳規(guī)律，了解掌握國(guó)內(nèi)單倍體誘導(dǎo)育種現(xiàn)狀有助于更好地利用單倍體技術(shù)進(jìn)行育種選系。

1單倍體的誘導(dǎo)機(jī)理和遺傳規(guī)律

單倍體(haploid)指體細(xì)胞中只攜帶有配子染色體數(shù)目的個(gè)體。單倍體可自然發(fā)生，也可通過人為方式誘導(dǎo)產(chǎn)生，而單倍體的誘導(dǎo)機(jī)理目前仍沒有明確的定論。學(xué)術(shù)界對(duì)此普遍持三大觀點(diǎn)：①精核異型，認(rèn)為有少量異常花粉存在于成熟的花粉細(xì)胞中，這部分花粉的2個(gè)精核形態(tài)1個(gè)正常，1個(gè)偏大未成熟或偏小已衰老，無(wú)法正常參與受精，這種單受精可能會(huì)誘發(fā)卵核產(chǎn)生單倍體胚；②染色體排除，在雜交過程中若雙親體細(xì)胞分裂周期不同步或者核蛋白質(zhì)合成時(shí)間不同步，造成一方親本的染色體丟失，形成單倍體[1]；③精核生殖單位的破壞，2個(gè)精細(xì)胞在花粉管中同時(shí)到達(dá)胚囊助細(xì)胞才能保證雙受精，若2個(gè)精子分開運(yùn)輸，未能同步到達(dá)胚囊，只有1個(gè)精子參與了受精，與極核融合后可能發(fā)育成單倍體[2]。

單倍體只擁有1組染色體，所攜帶的所有基因都是單一的，但同時(shí)配子體是一個(gè)完整協(xié)調(diào)的新陳代謝體系，具有正常的生理功能。研究發(fā)現(xiàn)單倍體攜帶的基因在后代的分離是隨機(jī)的，并且后代的基因型和表現(xiàn)型完全一致，無(wú)論是顯性基因還是隱性基因控制的性狀都能夠真實(shí)直觀的顯現(xiàn)。單倍體通過對(duì)配子體直接進(jìn)行選擇，加倍后所得到的雙單系的遺傳組成100%純合，具有穩(wěn)定的遺傳性，自交后代的數(shù)量性狀等遺傳變異也完全相同，不會(huì)出現(xiàn)性狀分離[3]。

2單倍體技術(shù)體系和國(guó)內(nèi)利用現(xiàn)狀

常規(guī)育種手段選育玉米自交系需要6～8代，難以滿足生產(chǎn)上對(duì)品種快速更新?lián)Q代的要求。單倍體技術(shù)只需利用誘導(dǎo)系與目標(biāo)材料雜交誘導(dǎo)、鑒選出單倍體、對(duì)單倍體二倍化即可獲得100%純合的自交系，該技術(shù)已成為國(guó)內(nèi)外大型種子公司選系的重要手段，與分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)和轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)形成了現(xiàn)代育種技術(shù)新體系。我國(guó)對(duì)單倍體技術(shù)的利用起步較晚，但發(fā)展很快，獲得了大量研究成果。

2.1單倍體誘導(dǎo)系的創(chuàng)制單倍體誘導(dǎo)途徑有離體培養(yǎng)、利用射線或化學(xué)藥物處理和活體誘導(dǎo)等。利用孤雌生殖誘導(dǎo)系雜交產(chǎn)生單倍體是一種誘導(dǎo)頻率高、操作簡(jiǎn)捷、成本低廉的方法，易于在玉米育種中大規(guī)模推廣[4]，優(yōu)良的誘導(dǎo)系是單倍體技術(shù)的利用前提和基礎(chǔ)。1959年Coe發(fā)現(xiàn)美國(guó)Northrup King公司的1份玉米材料作父本與其他玉米材料雜交后會(huì)產(chǎn)生一定比例的單倍體，為了從表型上區(qū)分出單倍體，導(dǎo)入籽粒色澤標(biāo)記基因R-nj和植株色澤標(biāo)記基因ABP1，將其命名為Stock6，這是第一個(gè)面世的單倍體誘導(dǎo)系[5]。國(guó)外學(xué)者在Stock6的基礎(chǔ)上進(jìn)行了不斷改良，1988年法國(guó)Lashermes從W23ig和Stock6雜交產(chǎn)生的F3代選育出WS14[6]。KMS、ZMS、MHI、RWS等高頻誘導(dǎo)系的創(chuàng)制，克服了Stock6的諸多缺陷。

我國(guó)第一個(gè)單倍體誘導(dǎo)系是1998年劉志增和宋同明通過Stock6與高油玉米改良群體BHO雜交選育出的農(nóng)大高誘1號(hào)[7]，至此打破了國(guó)外對(duì)單倍體誘導(dǎo)系的壟斷。此后國(guó)內(nèi)綜合性狀優(yōu)良、誘導(dǎo)頻率高且穩(wěn)定的單倍體誘導(dǎo)系不斷被創(chuàng)制出來(lái)。陳紹江[8]通過農(nóng)大高油高誘1號(hào)與UH400雜交組配，育成農(nóng)大高誘2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)一系列新誘導(dǎo)系。才卓[9]運(yùn)用Stock6和M278組配選育了吉高誘系3號(hào)。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)張姿麗和邱法展選育出誘導(dǎo)系HZI1[1]。廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院楊耀迥[10]通過B1和高誘1號(hào)雜交，育成Y8。目前國(guó)內(nèi)單倍體誘導(dǎo)系的誘導(dǎo)率和抗病性均有提高，投入生產(chǎn)應(yīng)用已成功得到雙單倍體材料，然而研究發(fā)現(xiàn)由于目前創(chuàng)制的誘導(dǎo)系多為溫帶誘導(dǎo)系，在熱帶或亞熱帶利用時(shí)易出現(xiàn)誘導(dǎo)率不穩(wěn)定、花粉量少、病害重等問題，且大多數(shù)是在Stock6的基礎(chǔ)上選育，而用于改良Stock基礎(chǔ)材料有限，限制了適應(yīng)當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)條件誘導(dǎo)系的創(chuàng)制。

2.2雜交誘導(dǎo)獲得單倍體雜交誘導(dǎo)是單倍體育種的第一環(huán)，單倍體的數(shù)量關(guān)系到能否順利開展后續(xù)步驟，為了盡可能多地獲得單倍體，應(yīng)選用誘導(dǎo)率高且穩(wěn)定、遺傳標(biāo)記明顯和綜合性狀優(yōu)良的誘導(dǎo)系作父本，選擇抗性佳、豐產(chǎn)性高、植株生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、品質(zhì)優(yōu)良的玉米材料作母本。蘇月貴[11]利用Stock6誘導(dǎo) 20份熱帶硬粒型玉米材料，誘導(dǎo)率均值為2.84%，這與普遍認(rèn)為Stock6的誘導(dǎo)率為3%的結(jié)論基本一致，而其變化幅度在0.84%～7.10%，推測(cè)原因?yàn)闊釒в衩追N質(zhì)的遺傳背景不同。張如養(yǎng)[12]通過京科誘041、043、044、045和京科誘005、006分別與6個(gè)不同基礎(chǔ)種質(zhì)類型的自交系雜交誘導(dǎo)后，發(fā)現(xiàn)6個(gè)誘導(dǎo)系的誘導(dǎo)率均值差異極大，其中京科誘043誘導(dǎo)率均值最高，達(dá)6.06%，京科誘041和045誘導(dǎo)率最低，為2.45%，這種誘導(dǎo)率的差異可能是受到父本基因型的影響。江禹奉[13]通過高誘1號(hào)與6份熱帶玉米材料雜交誘導(dǎo)，結(jié)果顯示高誘1號(hào)誘導(dǎo)率均值為1.66%。李國(guó)良[14]研究認(rèn)為高誘1號(hào)的誘導(dǎo)率均值為3.90%，低于劉志增[7]的研究結(jié)果(5.8%)。孫瑞[15]比較了高誘1號(hào)、高誘5號(hào)和MT1、MT2與國(guó)內(nèi)四大種質(zhì)類群旅大紅骨、瑞德、蘭卡斯特、唐四平頭雜交后誘導(dǎo)率的差異，結(jié)果表明高誘5號(hào)誘導(dǎo)率最高，均值達(dá)3.13%，蘇娟娟[16]的研究顯示高誘5號(hào)的誘導(dǎo)率為9.76%，顯著高于另外3個(gè)誘導(dǎo)系，推測(cè)與母本種質(zhì)基因型和種植條件有關(guān)。2014年劉麗[17]報(bào)道稱不同玉米產(chǎn)區(qū)的誘導(dǎo)率存在差異，通過MT1誘導(dǎo)國(guó)內(nèi)代表性玉米自交系后顯示北方春播玉米區(qū)誘導(dǎo)率最高，為5.16%，其次為南方丘陵和西南山地玉米區(qū)，為5.14%，黃淮海夏播玉米區(qū)最低為4.44%。

單倍體誘導(dǎo)率的差異不僅受到誘導(dǎo)系自身誘導(dǎo)能力和穩(wěn)定性的影響，同時(shí)與母本基因型和遺傳背景、種植環(huán)境、授粉時(shí)花絲長(zhǎng)度、育種者經(jīng)驗(yàn)程度等因素有關(guān)，而誘導(dǎo)系與母本材料的合理搭配還需進(jìn)一步探索。

2.3單倍體的篩選與鑒定單倍體的鑒定方法包括遺傳標(biāo)記鑒定法、形態(tài)學(xué)鑒定法、細(xì)胞學(xué)鑒定法、解剖學(xué)鑒定法、流式細(xì)胞儀鑒定法、分子標(biāo)記鑒定法和生理生化鑒定法[18]。結(jié)合遺傳標(biāo)記和田間植株形態(tài)篩選玉米單倍體在實(shí)際操作中最為簡(jiǎn)便。誘導(dǎo)系攜帶的籽粒色澤遺傳標(biāo)記基因R1-nj，雜交誘導(dǎo)后獲得的單倍體籽粒頂端糊粉層顯紫色、胚部或胚芽尖無(wú)顯色；若誘導(dǎo)系同時(shí)攜有控制不定根、葉鞘、莖稈形成紫紅色植株色澤標(biāo)記基因ABP1-1，所誘導(dǎo)產(chǎn)生的單倍體后代幼苗葉鞘不顯紫色[19]。研究認(rèn)為理想情況下，運(yùn)用籽粒和植株雙顯性遺傳標(biāo)記篩選出的單倍體準(zhǔn)確率可高達(dá)98%，但僅通過花青素顏色基因來(lái)鑒定容易受到基礎(chǔ)材料遺傳背景、CI或Idf等色素抑制基因、籽粒成熟度和含水量、基因表達(dá)的劑量效應(yīng)和操作者的主觀判斷等因素影響，結(jié)合田間表型特征能夠顯著提高鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。與正常的二倍體植株相比，單倍體植株較矮、生長(zhǎng)發(fā)育慢、葉片顏色淺，雌雄花期往往不協(xié)調(diào)，雄穗不育或育性極低[20]。

高軍[21]認(rèn)為利用遺傳標(biāo)記來(lái)篩選玉米單倍體是最有效可靠的方法，可以有效避免肉眼通過植株形態(tài)鑒定所產(chǎn)生的誤差。而Rober[22]研究提出籽粒色澤標(biāo)記基因R1-nj在歐洲硬粒型玉米和熱帶玉米種質(zhì)上的顯色程度不佳。2003年陳紹江[23]運(yùn)用高油分的花粉直感效應(yīng)來(lái)篩選單倍體，由于農(nóng)大高誘1號(hào)含油量高，花粉直感效應(yīng)明顯，以自交籽粒含油量為對(duì)照，雜交誘導(dǎo)后產(chǎn)生的籽粒用核磁共振儀測(cè)定油分含量，低于自交籽粒的即為單倍體籽粒，準(zhǔn)確率達(dá)90%以上，該法適用于高油誘導(dǎo)系且后代遺傳標(biāo)記不明顯的材料，如CHOI1。黎亮[24]提出可以通過流式細(xì)胞儀定量分析植物體內(nèi)細(xì)胞DNA含量，快速準(zhǔn)確篩選出單倍體，且不受取材部位限制。利用分子標(biāo)記檢測(cè)多態(tài)性差異，與母本帶型一致的為單倍體，帶型表現(xiàn)同時(shí)具有雙親基因型的為雜合二倍體。用顯微鏡鏡檢根尖或莖尖分生組織，通過染色體數(shù)目來(lái)判斷單倍體也是一種準(zhǔn)確有效的方法。準(zhǔn)確地篩選出單倍體不僅依賴于育種家的經(jīng)驗(yàn)技術(shù)，在生產(chǎn)實(shí)踐中還需要根據(jù)具體育種情況靈活運(yùn)用并不斷予以豐富發(fā)展，以克服目前鑒定方法中固有的弊端和局限性。近年來(lái)自動(dòng)化分揀技術(shù)受到了關(guān)注，例如運(yùn)用計(jì)算機(jī)視覺技術(shù)系統(tǒng)通過籽粒的胚乳和胚部的顏色特征判別單倍體；利用核磁共振儀基于油分花粉直感效應(yīng)原理開發(fā)出全自動(dòng)分揀系統(tǒng)；通過近紅外反射光譜結(jié)合SIMCA模型實(shí)現(xiàn)快速鑒選出單倍體等。

2.4單倍體的加倍單倍體植物高度不育，只有進(jìn)行染色體加倍才能使其成為可育的二倍體。雜交誘導(dǎo)產(chǎn)生的玉米單倍體90%以上的雌穗均能夠正常吐絲，然而一般情況下雄穗能自然恢復(fù)育性的不超過10%(不同基因型材料間差異很大)，因此單倍體雄穗育性問題是單倍體誘導(dǎo)育種應(yīng)用中的限制性難題。研究認(rèn)為，單倍體恢復(fù)二倍性或許是細(xì)胞的一種本能反應(yīng)，但受到遺傳背景和環(huán)境條件的影響，某些材料不發(fā)生自然加倍，依靠極低的自然加倍率很難滿足育種實(shí)踐，更多的需要進(jìn)行人工處理以獲得DH系[25]。

常用的人工加倍方法有浸種法、浸芽法、浸根法、注射法、涂抹法、包埋法和滴心法等。目前運(yùn)用較多的是秋水仙素配以二甲基亞砜，通過浸種、浸芽、浸根或注射的方式[26]對(duì)單倍體進(jìn)行處理，在細(xì)胞有絲分裂時(shí)期，打破紡錘絲的形成，使染色體不向兩極移動(dòng)而停留在赤道板附近，從而使有絲分裂失敗而實(shí)現(xiàn)加倍[27]。劉俊[28]用0.06%秋水仙素與2.0%二甲基亞砜對(duì)不同基因型母本材料誘導(dǎo)產(chǎn)生的單倍體通過浸根法、滴心法、針刺生長(zhǎng)點(diǎn)法進(jìn)行加倍處理，結(jié)果顯示針刺生長(zhǎng)點(diǎn)法的加倍率最高，達(dá)23%。王賀[29]用0.07% 秋水仙素處理芽尖8 h，加倍率高達(dá)16.5%。韓學(xué)莉[30]發(fā)現(xiàn)0.05%秋水仙素處理時(shí)，浸種法和浸芽法藥害率低但加倍效果較差，浸根法加倍率高同時(shí)藥害較重，注射法最為理想。文科[31]研究認(rèn)為浸根藥害最重，浸種和注射加倍率較高，但注射法對(duì)植株傷害較重。加倍效果與環(huán)境、加倍方法和材料類型的關(guān)系密切，通常來(lái)講浸種法是藥害程度最低的辦法，但其加倍效果還有待于進(jìn)一步優(yōu)化。秋水仙素為淡黃色劇毒粉末，在加倍實(shí)驗(yàn)中使用的濃度為0.02%～0.08%，需要專業(yè)人員小心操作。目前已有使用細(xì)胞分裂抑制劑(如APM、氟樂靈、拿草特、氨磺靈)、除草劑或一氧化二氮來(lái)替代秋水素的相關(guān)研究，然而加倍率不甚理想，未來(lái)期望發(fā)現(xiàn)更多無(wú)毒或低毒的高效加倍劑或加倍途徑，以減少操作的危險(xiǎn)性，并獲得更好的加倍效果。

3展望

單倍體技術(shù)在玉米育種中的應(yīng)用前景十分廣闊，但同時(shí)在生產(chǎn)實(shí)踐中也有其固有的局限性：①由于缺少常規(guī)育種各個(gè)分離世代遺傳基因的交換重組，無(wú)法分離積累更多的優(yōu)良基因型，不能有效打破不良基因連鎖；②誘導(dǎo)系材料不足且誘導(dǎo)率不穩(wěn)定，與不同基因型母本材料雜交誘導(dǎo)后差異顯著；③誘導(dǎo)率低，可能是受到親本遺傳背景、種植環(huán)境、溫度等因素的影響；④加倍率低，研究認(rèn)為秋水仙素的處理濃度和時(shí)間與加倍率成正比，但與成活率成反比。為克服以上困難首先需要?jiǎng)?chuàng)制出適應(yīng)當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)條件的優(yōu)良誘導(dǎo)系，在應(yīng)用該育種技術(shù)時(shí)還需合理選擇優(yōu)良互補(bǔ)基因型親本，快速有效地聚合有利基因，同時(shí)在適宜的環(huán)境和條件下種植以提高誘導(dǎo)率，并將人工處理溫度、時(shí)間和試劑濃度合理配比，探索出適應(yīng)特定組合的最佳加倍途徑，將加倍得到的雙單倍體種子在田間精密播種，妥善管理，通過植株長(zhǎng)勢(shì)、形狀、籽粒色澤對(duì)雙單倍體進(jìn)行確認(rèn)，將得到的DH系根據(jù)育種需要以去劣為原則進(jìn)一步選擇利用，同時(shí)與其他育種手段相結(jié)合以更好地應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。

目前國(guó)內(nèi)單倍體誘導(dǎo)育種技術(shù)主要是在普通玉米上利用，在鮮食玉米甜玉米、糯玉米、甜糯玉米上的利用研究相對(duì)較少，可供參考的文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)也比較匱乏。呂桂華[32]研究發(fā)現(xiàn)糯玉米和普通玉米材料誘導(dǎo)率高于甜玉米。李高科[33]通過Stock6與甜玉米雜交誘導(dǎo)后，在24 ℃條件下用0.02%秋水仙素浸泡種子32 h，成功獲得了DH系，并用SSR標(biāo)記對(duì)其純度進(jìn)行了鑒定。以上研究表明將單倍體技術(shù)應(yīng)用于鮮食玉米具有可行性。運(yùn)用該育種方法指導(dǎo)鮮食玉米的育種實(shí)踐，能顯著提高鮮食玉米材料創(chuàng)制過程中的準(zhǔn)確性，為鮮食玉米雙(多)隱性材料的創(chuàng)制提供一種新途徑，符合改良鮮食玉米品質(zhì)需求的發(fā)展趨勢(shì)。然而同一單倍體誘導(dǎo)系分別與甜玉米、糯玉米、甜糯玉米雜交后的誘導(dǎo)率是否存在差異、哪種誘導(dǎo)系在鮮食玉米上的誘導(dǎo)效果更好、遺傳標(biāo)記基因在不同的鮮食玉米材料中顯色程度如何、如何更好地提高鮮食玉米單倍體的加倍效果等問題都是目前亟需解決的，未來(lái)還需努力探索形成單倍體技術(shù)在鮮食玉米利用的新體系，以發(fā)揮單倍體技術(shù)在鮮食玉米育種中的利用優(yōu)勢(shì)。

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Utilization and Development Prospect of Haploid Breeding Technology in Maize

SONG Qiao-heng, YANG Yue-hua, KONG Liang-liang et al

(Rice and Sorghum Research Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Deyang, Sichuan 618000)

AbstractWe introduced the application advantage of haploid technology in maize breeding, induced mechanism and genetic regularity of haploid, necessary link for haploid breeding technology of maize, and the utilization status in China. At the same time, the limitations and difficulties of haploid technology application were discussed. The possibility of using this technology in the breeding of fresh edible maize was forecasted.

Key wordsMaize; Haploid technology; Induced breeding; Development prospect

基金項(xiàng)目四川省“十二五”農(nóng)作物育種攻關(guān)甜、糯玉米雜交種選育子專題(2011NZ0098-2)；四川省“十二五”財(cái)政創(chuàng)新能力提升工程：甜糯玉米種質(zhì)資源創(chuàng)新及新品種培育(2016ZYPZ-037)。

作者簡(jiǎn)介宋俏姮(1989-)，女，四川峨眉山人，研究實(shí)習(xí)員，碩士，從事玉米遺傳育種研究。

收稿日期2016-02-20

中圖分類號(hào)S 513

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)08-023-03