二肽酰肽酶-4抑制劑通過PKA/NF-κB信號通路調節LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥反應的實驗研究*

黃玉芳　鄧文　朱濤

(遂寧市中心醫院，1.呼吸中心;2.骨科中心, 四川 遂寧 629000;3.四川大學華西醫院呼吸病學研究室/呼吸內科， 四川 成都 610041)

?

二肽酰肽酶-4抑制劑通過PKA/NF-κB信號通路調節LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥反應的實驗研究*

黃玉芳1鄧文2朱濤3

(遂寧市中心醫院，1.呼吸中心;2.骨科中心, 四川 遂寧 629000;3.四川大學華西醫院呼吸病學研究室/呼吸內科， 四川 成都 610041)

【摘要】目的探討二肽酰肽酶-4(DPP-4)競爭性抑制劑沙格列汀對LPS誘導的小鼠巨噬細胞(RAW264.7細胞)炎癥反應的調節作用及相關的分子機制。方法將RAW264.7細胞分為4組，分別為對照組(Control組)、LPS組、LPS+沙格列汀 (LPS+SAX組)和LPS+沙格列汀+PKA抑制劑H-89組(LPS+SAX+H-89組)。在干預6小時后使用qPCR法和western blot法對細胞ICAM-1 mRNA和蛋白的表達水平進行檢測；并采用western blot法對細胞PKA和NF-κB p65活化水平進行分析。結果與Control組相比較，在LPS干預6小時后 RAW264.7細胞ICAM-1 mRNA和蛋白的表達水平及NF-κB p65活化水平均明顯上升，而PKA活化水平明顯降低，差異均有統計學意義(P均<0.05)；但LPS組較LPS+SAX組ICAM-1表達和NF-κB p65活化水平的增加更明顯，而PKA活化下降更加明顯，差異均有統計學意義(P均<0.05)。同時發現在LPS誘導狀態下沙格列汀對于ICAM-1表達和NF-κB p65活化水平的抑制作用和PKA活化水平的促進作用可被PKA抑制劑H-89顯著拮抗，差異均有統計學意義(P均<0.05)。結論本研究顯示DPP-4抑制劑可以通過調控PKA/NF-κB信號通路下調LPS誘導的小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞的炎癥反應，為DPP-4抑制劑應用于炎癥性疾病的治療奠定了初步的理論基礎。

【關鍵詞】沙格列汀； RAW264.7細胞； 細胞內細胞黏附分-1 (ICAM-1)； 蛋白激酶A (PKA)； 核轉錄因子-κB (NF-κB)

DPP-4 inhibitor modulates LPS-induced inflammation via PKA/NF-κB signaling pathway in RAW264.7 cellsHUANG Yufang1, DENG Wen2, ZHU Tao3

(1.DepartmentofRespiratory,CentralHospitalofSuining,Suining629000,Sichuan,China;

2.DepartmentofOrthopedics,CentralHospitalofSuining,Suining629000,Sichuan,China;

3.DivisionofPulmonaryDiseases,StateKeyLaboratoryofBiotherapyofChina,Departmentof

RespiratoryMedicine,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the anti-inflammatory property of DPP-4 (dipeptidyl peptidase-4) inhibitor saxagliptin in LPS-induced inflammation in RAW264.7 cells and its underlying mechanism. MethodsRAW264.7 cells were separated into Control group, LPS group, LPS+saxagliptin group (LPS+SAX group) and LPS+saxagliptin+PKA inhibitor H-89 group (LPS+SAX+H-89 group). After 6 hours interventions, qPCR and Western blot were used to detect the mRNA and protein expression of ICAM-1. Then, the phosphorylation of PKA and NF-κB p65 were also measured by western blot. ResultsAfter 6 hours LPS stimulation, the mRNA and protein expression of ICAM-1 was significantly up-regulated, the phosphorylation of NF-κB p65 was markedly enhanced and the phosphorylation of PKA was largely reduced in RAW264.7 cells. Our data showed that LPS-induced expression of ICAM-1, LPS-enhanced phosphorylation of NF-κB p65 and LPS-reduced the phosphorylation of PKA were all substantially improved by saxagliptin. Meanwhile, we also found that these effects of saxagliptin were noticeably abrogated by PKA inhibitor H-89 in RAW264.7 cells. ConclusionsDPP-4 inhibitor saxagliptin could attenuate LPS-induced inflammation via modulation of PKA/NF-κB signaling pathway in RAW264.7 cells.

【Key words】Saxagliptin; RAW264.7 cells; ICAM-1; PKA; NF-κB

巨噬細胞(macrophages)作為重要的固有免疫參與者，其過度激活在包括重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)、膿毒血癥休克(sepsis shock)和急性呼吸窘迫綜合癥(acute respiratory distress syndrome, ARDS)等多種炎癥性疾病中扮演著重要的角色[1-5]。過度活化的巨噬細胞一方面有利于致炎因子和損傷因子的清除，另一方面其合成和分泌大量的炎癥介質和炎癥分子又對炎癥部位的組織細胞產生直接和間接的損傷，最終導致器官的二次損害[6-8]。目前大量的研究發現胰高血糖素樣肽-1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1)和二肽酰肽酶-4抑制劑(dipeptidyl peptidase-4 inhibitor)對炎癥反應有重要的調節作用，且進一步的實驗表明DPP-4抑制劑的抗炎作用與調控PKA信號通路密切相關[9-11]。該基礎研究的目的是探討DPP-4競爭性抑制劑沙格列汀對LPS誘導的小鼠巨噬細胞(RAW264.7細胞)炎癥反應的調節作用，及其潛在的分子機制。

1材料和方法

1.1主要試劑和材料TRIzol試劑和qPCR試劑盒均購買于日本Takara公司；兔抗鼠ICAM-1抗體、兔抗鼠磷酸化-PKA抗體、兔抗鼠PKA抗體、兔抗鼠磷酸化-NF-κB p65抗體、兔抗鼠NF-κB p65抗體和兔抗鼠β-actin抗體均購于美國Santa Cruz公司；沙格列汀購于上海施貴寶公司，DMEM培養基購于美國Gibco公司，超純水。其余試劑均為分析純。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞常規接種在含10%胎牛血清、100 g/L 青霉素、100 g/L鏈霉素的DMEM培養液中，置于37℃、95%空氣、5 % CO2孵箱內培養。每48 h換液、傳代2次，取對數生長期細胞用于實驗。RAW264.7細胞分為對照組(Control組)、LPS組、LPS+沙格列汀 (LPS+SAX組)和LPS+沙格列汀+PKA抑制劑H-89組(LPS+SAX+H-89組)。其中對照組細胞加入PBS；LPS組、LPS+SAX組和LPS+SAX+H-89組加入終濃度為1 μg/ml 的LPS溶液進行干預；LPS+SAX組加入終濃度為0.5 μM的沙格列汀進行干預；LPS+SAX+H-89組加入終濃度為1μM的PKA抑制劑H-89進行干預。

1.2.2細胞ICAM-1 mRNA表達檢測 qPCR法檢測MCP-1和HMGB1 mRNA表達水平，按照試劑盒說明書提取細胞的總RNA并合成cDNA。然后進行熒光定量PCR擴增，反應體系為25 μl，使用β-actin作為內參照。引物序列如下：ICAM-1正義5′-AGGTGT GATATCCG GTAGAT-3′，反義5′-CCTT CTAAGT GGTTGGAACA-3′；β-actin：正義：5′-CCCAG CACAATGA AGATCAAGA TCAT-3′，反義：5′-ATCTG CTGGAAGGT GGACAGCGA-3′。使用2-ΔΔCt法對ICAM-1 mRNA表達水平進行測定，ΔΔCt = (Ct,目標-Ct, β-actin)干預組-(Ct,目標-Ct,β-actin)對照組[3]。

1.2.3Western blot法檢測細胞中ICAM-1蛋白表達水平以及PKA活化水平和NF-κB p65活化水平干預6h后，按照試劑盒操作要求，首先提取RAW264.7細胞總蛋白，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1 h，分別加入抗ICAM-1抗體(1∶1200)、抗磷酸化-PKA抗體(1∶1200)、抗PKA抗體(1∶1200)、抗磷酸化-NF-κB p65抗體(1∶1200)、抗NF-κB p65抗體(1∶1200)和抗β-actin抗體(1∶1500)，4℃孵育過夜，洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶ 1000)，用ECL進行顯色，用凝膠成像分析系統進行掃描。

1.3統計學分析計量資料以均數±標準差表示。采用SPSS 11.0進行單因素方差分析，兩樣本均數多重比較采用LSD法，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1ICAM-1 mRNA和蛋白的表達干預6h后，對RAW264.7細胞ICAM-1 mRNA和蛋白的表達水平使用qPCR法和western blot法進行檢測。與Control組相比較，在LPS干預后ICAM-1 mRNA和蛋白的表達水平明顯增加，差異均有統計學意義(P均<0.05)。但LPS組較LPS+SAX組ICAM-1 mRNA和蛋白的表達增加更加明顯，差異均有統計學意義(P均<0.05)。同時，在LPS誘導狀態下SAX對于ICAM-1 mRNA和蛋白的表達的抑制作用可被PKA抑制劑H-89顯著拮抗，差異均有統計學意義(P均<0.05)，見表1和圖1。

表1　RAW264.7細胞MCP-1 mRNA和蛋白表達水平及PKA與NF-κB p65活化水平

注：與對照組相比較①P<0.05；與LPS組相比較②P<0.05；與LPS+SAX組相比較③P<0.05。

圖1RAW264.7細胞ICAM-1蛋白表達的western blot結果

Figure 1The western blot results of ICAM-1 expression in RAW264.7 cells

2.2PKA的活化水平干預6h后，對RAW264.7細胞PKA的活化水平使用western blot法進行檢測。與Control組相比較，在LPS干預后PKA的活化水平明顯下降，差異均有統計學意義(P均<0.05)。但LPS組較LPS+SAX組PKA的活化水平下降更加明顯，差異均有統計學意義(P均<0.05)。同時，在LPS誘導狀態下SAX對于PKA的活化水平的促進作用可被PKA抑制劑H-89顯著拮抗，差異均有統計學意義(P均<0.05),見表1和圖2。

圖2RAW264.7細胞PKA磷酸化水平的western blot結果

Figure 2The western blot results of the phosphorylation of PKA in RAW264.7 cells

2.3NF-κB p65的活化水平干預6h后，對RAW264.7細胞NF-κB p65的活化水平使用western blot法進行檢測。與Control組相比較，在LPS干預后NF-κB p65的活化水平明顯增加，差異均有統計學意義(P均<0.05)。但LPS組較LPS+SAX組NF-κB p65的活化水平增加更加明顯，差異均有統計學意義(P均<0.05)。同時，在LPS誘導狀態下SAX對于NF-κB p65的活化水平的抑制作用可被PKA抑制劑H-89顯著拮抗，差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表1和圖3。

3討論

直到目前急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)的發病機制至今仍未完全闡明，治療仍以支持治療和對癥治療為主，無特異手段，病死率極高，據美國胸科協會(ATS)數據顯示ARDS的全因死亡率高達45%~65%，而部分的數據顯示我國ARDS的死亡率在60%~85%左右[12~15]。

圖3RAW264.7細胞NF-κB p65磷酸化水平的western blot結果

Figure 3The western blot results of the phosphorylation of NF-κB p65 in RAW264.7 cells

目前認為多種基本病理過程如細胞自噬、氧化應激、炎癥反應和凋亡失衡等均參與了ARDS的發生與發展[12-15]。但研究發現過度的自我放大而失控的肺部炎癥反應是ARDS發生的始發因素和根本原因，其中單核-巨噬細胞為主的炎癥細胞過度激活是ARDS發病的起始環節[12-15]。目前大量研究表明阻斷炎癥細胞激活可有效的改善ARDS的病理變化，對肺組織產生保護作用[12-17]。

GLP-1是腸道內分泌L細胞(L cells)分泌的一種腦腸肽。目前研究證實GLP-1與糖代謝密切相關，高脂肪和高碳水化合物食物是促進GLP-1分泌的主要調節因素，同時發現DPP-4 (dipeptidy-peptidase 4, DPP-4)是代謝GLP-1的限速酶，目前GLP-1擬似物如利拉魯肽和艾塞那肽以及DPP-4抑制劑沙格列汀和維格列汀等均已應用于2型糖尿病的臨床治療[9-11, 18]。近來大量的研究發現除糖脂代謝外，GLP-1擬似物和DPP-4抑制劑還具有抑制炎癥反應、抑制氧化應激及改善器官纖維化等藥理學作用[19-21]。Steven S等的研究顯示DPP-4抑制劑沙格列汀和GLP-1擬似物利拉魯肽均可以有效減輕LPS誘導的膿毒血癥小鼠炎癥反應水平并改善其生存率[19]。Krasner NM等的研究發現利拉魯肽可以有效的抑制LPS或TNF-α誘導的人主動脈內皮細胞(human aortic endothelial cells, HAECs) 炎癥分子VCAM-1和E-Selectin表達[20]。同時有研究顯示炎癥狀態下巨噬細胞ICAM-1的合成顯著增加，上調的ICAM-1可以有效的促進巨噬細胞與炎癥部位組織細胞的粘附和聚集，并認為ICAM-1的表達水平與炎癥反應程度密切相關[21]。在本研究中我們發現與Control組相比較，在LPS干預后ICAM-1 mRNA和蛋白的表達水平明顯增加；但LPS組較LPS+SAX組ICAM-1 mRNA和蛋白的表達增加更加明顯。該結果表明DPP-4抑制劑沙格列汀可以有效下調LPS誘導的RAW264.7細胞的炎癥反應水平。

近期研究表明GLP-1擬似物和DPP-4抑制劑調節炎癥反應和改善脂代謝等生物學作用與調節蛋白激酶A (PKA)的活化密切相關[9~11]。在本研究中我們發現與Control組相比較，在LPS干預后PKA的活化水平明顯下降。但LPS組較LPS+SAX組PKA的活化水平下降更加明顯。同時，在LPS誘導狀態下沙格列汀對于KA的活化水平的促進作用可被PKA抑制劑H-89顯著拮抗。同時進一步的研究顯示在多種炎癥狀態下PKA活化狀態與NF-κB的磷酸化水平密切相關，而后者在炎癥調控中扮演著重要的角色，抑制NF-κB活化或下調其表達均可有效的改善炎癥反應水平[23]。且NF-κB信號通路在炎癥狀態下對于巨噬細胞ICAM-1的表達有關鍵的調控作用[24]。在本研究中我們發現與Control組相比較，在LPS干預后NF-κB p65的活化水平明顯增加；但LPS組較LPS+SAX組NF-κB p65的活化水平增加更加明顯。同時，在LPS誘導狀態下沙格列汀對于對于ICAM-1 mRNA和蛋白的表達以及NF-κB p65活化水平的抑制作用均可被PKA抑制劑H-89顯著拮抗。以上結果表明在LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥狀態下DPP-4抑制劑沙格列汀可以通過促進PKA的活化有效的下調NF-κB p65的磷酸化水平，并下調炎癥分子ICAM-1的表達。

4結論

本研究顯示，DPP-4抑制劑可以通過調控PKA/NF-κB信號通路下調LPS誘導的小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞的炎癥反應，為DPP-4抑制劑應用于臨床炎癥性疾病治療奠定了初步的理論基礎。

【參考文獻】

[1]唐丹, 陳曉平, 陳國柱, 等. 氟伐他汀對動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細胞凋亡的影響[J]. 西部醫學, 2008, 20(01): 10-12.

[2]張偉義, 朱濤. 脂多糖LPS對糖尿病大鼠肺泡巨噬細胞RBD-2表達的影響[J]. 西部醫學, 2011, 23(09): 1629-1633.

[3]Xiao M, Zhu T, Zhang W,etal. Emodin Ameliorates LPS-Induced Acute Lung Injury, Involving the Inactivation of NF-κB in Mice [J]. IJMS, 2014, 15(11):19355-19368.

[4]Selvaraj V, Manne ND, Arvapalli R,etal. Effect of cerium oxide nanoparticles on sepsis induced mortality and NF-κB signaling in cultured macrophages [J]. Nanomedicine (Lond), 2015, 10(8):1275-1288.

[5]Ni Q, Sun K, Chen G,etal. In vitro effects of emodin on peritoneal macrophages that express membrane-bound CD14 protein in a rat model of severe acute pancreatitis/systemic inflammatory response syndrome [J]. Mol Med Rep, 2014, 9(1):355-359.

[6]Lee TS, Lu KY, Yu YB,etal. β Common Receptor Mediates Erythropoietin-Conferred Protection on OxLDL-Induced Lipid Accumulation and Inflammation in Macrophages [J]. Mediators Inflamm, 2015, 2015:439759.

[7]Song Y, Liu X, Yue H,etal. Anti-inflammatory effects of benzenediamine derivate FC-98 on sepsis injury in mice via suppression of JNK, NF-κB and IRF3 signaling pathways [J]. Mol Immunol, 2015,(15):00386-00387.

[8]姜鵬, 王建春, 趙詠梅, 等. Wy14643對急性肺損傷大鼠肺組織抗炎作用的實驗研究[J]. 西部醫學, 2009, 21(01): 9-12.

[9]Dai Y, Dai D, Wang X,etal. DPP-4 inhibitors repress NLRP3 inflammasome and interleukin-1beta via GLP-1 receptor in macrophages through protein kinase C pathway [J]. Cardiovasc Drugs Ther, 2014, 28(5):425-432.

[10] Ge GH, Dou HJ, Yang SS,etal. Glucagon-like peptide-1 protects against cardiac microvascular endothelial cells injured by high glucose [J]. Asian Pac J Trop Med, 2015, 8(1):73-78.

[11] Rajan S, Dickson LM, Mathew E,etal. Chronic hyperglycemia downregulates GLP-1 receptor signaling in pancreatic β-cells via protein kinase A [J]. Mol Metab, 2015, 4(4):265-276.

[12] 張維, 朱濤, 王導新. 胰島素通過激活SGK1對LPS誘導的急性肺損傷狀態下鈉離子通道的調節作用[J]. 西部醫學, 2013, 25(01): 3-7.

[13] Tao Zhu, Dao-xin Wang, Wei Zhang,etal. Andrographolide Protects Against LPS-induced Acute Lung Injury by Inactivation of NF-κB [J]. Plos One, 2013, 8(2): 56407.

[14] 朱濤, 肖敏, 文富強, 等. 脫氫穿心蓮內酯琥珀酸半酯上調水通道蛋白5減輕LPS誘導的急性肺損傷肺水腫的實驗研究[J]. 西部醫學, 2014, 26(01): 16-18,22.

[15] Ferguson ND, Fan E, Camporota L,etal. The Berlin definition of ARDS: an expanded rationale, justification, and supplementary material [J]. Intensive Care Med, 2012, 38(10):1573-1582.

[16] Reddy NM, Potteti HR, Vegiraju S,etal. PI3K-AKT Signaling via Nrf2 Protects against Hyperoxia-Induced Acute Lung Injury, but Promotes Inflammation Post-Injury Independent of Nrf2 in Mice [J]. PLoS One, 2015, 10(6):0129676.

[17] Lv H, Zhu C, Liao Y,etal. Tenuigenin ameliorates acute lung injury by inhibiting NF-κB and MAPK signalling pathways [J]. Respir Physiol Neurobiol, 2015, 216:43-51.

[18] Lovshin JA, Barnie A, DeAlmeida A,etal. Liraglutide promotes natriuresis but does not increase circulating levels of atrial natriuretic peptide in hypertensive subjects with type 2 diabetes [J]. Diabetes Care, 2015, 38(1):132-139.

[19] Steven S, Hausding M, Kr?ller-Sch?n S,etal. Gliptin and GLP-1 analog treatment improves survival and vascular inflammation/dysfunction in animals with lipopolysaccharide-induced endotoxemia [J]. Basic Res Cardiol, 2015, 110(2):6.

[20] Krasner NM, Ido Y, Ruderman NB,etal. Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) analog liraglutide inhibits endothelial cell inflammation through a calcium and AMPK dependent mechanism [J]. PLoS One, 2014, 9(5):97554.

[21] Gou S, Zhu T, Wang W,etal. Glucagon like peptide-1 attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis, involving the inactivation of NF-κB in mice [J]. Int Immunopharmacol, 2014, 22(2): 498-504.

[22] Kim S, Joo YE. Theaflavin Inhibits LPS-Induced IL-6, MCP-1, and ICAM-1 Expression in Bone Marrow-Derived Macrophages Through the Blockade of NF-κB and MAPK Signaling Pathways [J]. Chonnam Med J, 2011, 47(2): 104-110.

[23] Lee JH, Jung NH, Lee BH,etal. Suppression of Heme Oxygenase-1 by Prostaglandin E2-Protein Kinase A-A-Kinase Anchoring Protein Signaling Is Central for Augmented Cyclooxygenase-2 Expression in Lipopolysaccharide-Stimulated RAW 264.7 Macrophages [J]. Allergy Asthma Immunol Res, 2013, 5(5): 329-336.

[24] Guo R, Liu B, Wang K,etal. Resveratrol ameliorates diabetic vascular inflammation and macrophage infiltration in db/db mice by inhibiting the NF-κB pathway [J]. Diab Vasc Dis Res, 2014, 11(2):92-102.

(收稿日期：2015-06-29； 編輯： 陳舟貴)

通訊作者：朱濤，E-mail:zhutao063020@163.com

基金項目：中國博士后科學基金(2014M552369) ；四川省醫學會科研課題(171140342)

【中圖分類號】R 446.62

【文獻標志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.01.007