桑皮素通過抑制STAT3磷酸化下調卵巢癌SKOV3細胞Cyclin D1表達的實驗研究*

鄧潔　張小霞　鄧曉楊　彭聰　羅劍波　朱濤

(1.成都醫學院第一附屬醫院， 四川 成都 610500;2.四川大學華西醫院呼吸病學研究室/呼吸內科， 四川 成都 610041)

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桑皮素通過抑制STAT3磷酸化下調卵巢癌SKOV3細胞Cyclin D1表達的實驗研究*

鄧潔1張小霞1鄧曉楊1彭聰1羅劍波1朱濤2

(1.成都醫學院第一附屬醫院， 四川 成都 610500;2.四川大學華西醫院呼吸病學研究室/呼吸內科， 四川 成都 610041)

【摘要】目的探討桑皮素對卵巢癌SKOV3細胞的抑制作用和對Cyclin D1表達的調節作用及潛在的分子機制。方法使用不同濃度的桑皮素 (0μM、10μM和50μM)對卵巢癌SKOV3細胞進行干預。在不同時間點(0 h、24h和48h)使用MTT法對SKOV3細胞活性進行測定。在干預48h后，使用qPCR對在不同濃度桑皮素干預的SKOV3細胞Cyclin D1 mRNA的表達水平進行測定。使用western blot對在不同濃度桑皮素的SKOV3細胞Cyclin D1蛋白表達水平和STAT3磷酸化水平進行測定。結果使用不同濃度桑皮素對卵巢癌SKOV3細胞進行干預后，細胞活性呈時間依賴性和濃度依賴性降低，差異均存在顯著統計學意義(P均<0.05)。桑皮素干預48h后，卵巢癌SKOV3細胞Cyclin D1 mRNA和蛋白的表達水平以及STAT3磷酸化水平水平呈濃度依賴性的下降，差異均存在顯著統計學意義(P均<0.05)。結論本實驗表明桑皮素可以通過抑制STAT3磷酸化顯著抑制卵巢癌SKOV3細胞的增殖并下調Cyclin D1的表達。

【關鍵詞】桑皮素； 卵巢癌； SKOV3細胞； 細胞周期蛋白D1； STAT3

Morusin down-regulates Cyclin D1 expression by inactivation of STAT3 in ovarian cancer SKOV3 cellsDENG Jie1, ZHANG Xiaoxia1, PENG Cong1,etal

(1.DepartmentofGynecology,TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollage,Chengdu610000,China;

2.DivisionofPulmonaryDiseases,StateKeyLaboratoryofBiotherapyofChina,DepartmentofRespiratoryMedicine,

WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the anti-tumor property of morusin in ovarian cancer SKOV3 cells and its underlying mechanism. MethodsSKOV3 cells were treated with three different concentrations (0μM, 10μM and 50μM) of morusin. At different time points (0h, 24h and 48h), MTT assay was used to detect the cell viabilities. QPCR was performed to measure the mRNA expression of Cyclin D1. The protein expression of Cyclin D1 and phosphorylation of STAT3 were analyzed by Western blot.ResultsThe cell viabilities of ovarian cancer SKOV3 cells were concentration-dependently and time-dependently inhibited by morusin. The mRNA and protein expression of Cyclin D1 and the phosphorylation of STAT3 were all concentration-dependently inhibited by morusin in ovarian cancer SKOV3 cells, after 48 hours interventions. ConclusionsMorusin could suppress the proliferation of ovarian cancer SKOV3 cells and Cyclin D1 expression probably through inactivation of STAT3.

【Key words】Morusin; Ovarian cancer; SKOV3 cells; Cyclin D1; STAT3

研究證實卵巢癌(ovarian cancer)是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，具有病理類型多樣，惡性程度高的生物學特點[1-4]。根據美國癌癥協會(American Cancer Society, ACS)的流行病學調查研究發現美國卵巢癌患者5年生存率僅44%左右[1-7]。桑皮素(morusin)是中藥桑枝的主要藥理成分之一。目前發現桑皮素具有促進和改善糖脂代謝、抑制氧化應激、抗病毒、促進腫瘤凋亡、抑制腫瘤增殖及轉移等多種藥理活性[8-11]。進一步研究發現桑皮素的生物活性與抑制STAT3活化密切相關。本實驗的目的是探討桑皮素對卵巢癌SKOV3細胞的抑制作用和對Cyclin D1表達的調節作用及潛在的分子機制。

1材料和方法

1.1主要試劑和材料第一鏈cDNA合成試劑盒和PCR試劑盒購自日本Takara公司；iQTM5 Multicolor Real-Time PCR Detection System購買于美國百樂公司；鼠抗人Cyclin D1抗體、鼠抗人phospho-STAT3抗體、鼠抗人STAT3抗體和鼠抗人β-actin抗體購于美國Cell Signaling公司；桑皮素購買于美國Sigma公司；DMEM培養基購買于美國Gibco公司；小牛血清購買于杭州四季清公司；MTT試劑盒購買于美國Promega公司；超純水；其余試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1細胞培養卵巢癌SKOV3細胞常規接種在含10% FBS、100g/L 青霉素、100 g/L鏈霉素的RPMI-1640培養液中，置于37℃、95%空氣、5 % CO2孵箱內培養。每48 h換液、傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2細胞活性檢測取對數生長期細胞消化制成單細胞懸液，接種于96 孔培養板中，每孔接種100 μL約含5×103個細胞。貼壁后無血清培養細胞16h至24h，使細胞同步化。加入不同終濃度(0μM、10μM和50μM)的桑皮素，在37℃，5 % CO2條件下培養細胞，0μM DAPT干預組細胞作為對照組。使用MTT比色試驗對不同時間點(0h、24h和48 h)的細胞生長狀態進行測定，實驗重復4次。對應時間點的細胞活性(%)=(OD干預組/OD對照組) ×100(%)[12]。

1.2.3細胞Cyclin D1 mRNA表達檢測按照試劑盒說明書提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行qPCR反應。Cyclin D1正義 5′-CGTGGG CTCTAAGA TGAAGG-3′，反義5′-TGCGG ATGATCTGTT TGTTC-3′；β-actin正義：5′-TGGCA TTGCCG ACAG GAT-3′，反義：5′-GCTCAGGAG GAGCAAT GATCT-3′。使用β-actin作為內參基因，使用2-△△CT公式計算目的基因相對表達量。ΔΔCt = (Ct,目標-Ct,β-actin)干預組-(Ct,目標-Ct,β-actin)對照組[13]。

1.2.4Western blot法檢測細胞中Cyclin D1蛋白表達水平和STAT3磷酸化水平按試劑盒操作先提取細胞總蛋白，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1 h，分別加入鼠抗人單克隆抗體鼠抗人Cyclin D1抗體、鼠抗人phospho-STAT3抗體、鼠抗人STAT3抗體和鼠抗人β-actin抗體，4℃孵育過夜，洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶2000)，用ECL進行顯色，用凝膠成像分析系統進行掃描。

1.3統計學分析計量資料以均數±標準差表示。采用SPSS 21.0進行單因素方差分析，兩樣本均數多重比較采用LSD法，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1MTT法結果分析在不同濃度(0μM、10μM和50μM)桑皮素干預后，使用MTT法對不同時間點(0h、24h和48h)卵巢癌SKOV3細胞活性進行測定。發現給予桑皮素干預的卵巢癌SKOV3細胞活性呈濃度依賴性和時間依賴性下降，差異均存在顯著統計學意義(P均<0.05)，見表1。

Table 1Cell viabilities of SKOV3 cells in different time points

藥物濃度MTT不同時間點檢測(×10-2)0h24h48h0μM10010010010μM103.41±2.1978.15±14.09①51.12±9.18①50μM102.66±2.0655.67±10.25①②34.26±6.04①②

注：對應時間點與0μM相比較①P<0.05，對應時間點與10μM相比較②P<0.05。

2.2Cyclin D1 mRNA和蛋白的表達在給予卵巢癌SKOV3細胞不同濃度(0μM、10μM和50μM)桑皮素干預48h后，使用qPCR和western blot法對細胞Cyclin D1 mRNA和蛋白的表達進行檢測。與為干預細胞相比較，給予桑皮素干預的細胞Cyclin D1 mRNA和蛋白表達水平呈濃度依賴性降低，差異均存在顯著統計學意義(P均<0.05)，見圖1，表2。

圖1SKOV3細胞Cyclin D1蛋白表達的western blot結果

Figure 1Western blot result of the protein expression of Cyclin D1 in SKOV3 cells

Table 2The mRNA and protein expression levels of Cyclin D1 and the phosphorylation of STAT3 in SKOV3 cells

藥物濃度CyclinD1mRNACyclinD1蛋白STAT3磷酸化水平0μM10.98±0.05 0.95±0.07 10μM0.57±0.22①0.64±0.14①0.58±0.12①50μM0.31±0.13①②0.29±0.06①②0.36±0.09①②

注：與0μM相比較①P<0.05，與10μM相比較②P<0.05

2.3STAT3磷酸化水平在給予SKOV3細胞不同濃度(0μM、10μM和50μM)桑皮素干預48h后，使用western blot法對細胞STAT3磷酸化水平(phospho-STAT3/total STAT3)進行檢測。與未干預細胞相比較，給予桑皮素干預后的SKOV3細胞STAT3磷酸化水平呈劑量依賴性降低，差異均有顯著統計學意義(P均<0.05)。見圖2，表2。

圖2SKOV3細胞STAT3磷酸化的western blot結果

Figure 2Western blot result of the phosphorylation of STAT3 in SKOV3 cells

3討論

研究證實卵巢癌(ovarian cancer)是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，其發病率僅次于宮頸癌和子宮體癌[1-7, 14, 15]。由于卵巢組織結構復雜，且均可發生腫瘤性病變，目前認為卵巢是全身器官中腫瘤病理類型最多的器官，其主要包括漿液性腫瘤、粘液性腫瘤和宮內膜樣腫瘤最為常見。卵巢癌惡性程度普遍較高，同時由于卵巢位置處于盆腔深處，故發現一般較晚，約61%的患者診斷時已處于進展期，預后多不理想[1-7, 14, 15]。根據美國癌癥協會(American Cancer Society, ACS)的流行病學調查研究發現美國卵巢癌患者平均年齡為63歲，5年生存率低于50%[1-7, 14, 15]。

桑皮素(morusin)是中藥桑枝的主要藥理成分之一。目前發現桑皮素具有促進和改善糖脂代謝、抑制氧化應激、抗病毒、促進腫瘤凋亡、抑制腫瘤增殖及轉移等多種藥理活性[8-11]。金曉明等的實驗結果表明桑皮素可有效改善鏈脲霉素誘導的糖尿病大鼠血糖、胰島素及糖化血紅蛋白等指標[16]。Syahdi RR等發現桑皮素具有抑制HIV-1病毒逆轉錄的作用[17]。Lee HJ等的研究發現桑皮素對一氧化氮(NO)誘導的SH-SY5Y細胞損傷有保護作用[18]。Lim SL等研究發現桑皮素可以通過促進腫瘤細胞凋亡有效抑制前列腺癌DU145細胞、M2182細胞和PC3細胞的增殖[19]。Lin WL等報道證實桑皮素對人肝癌SK-Hep1細胞MMP-2和MMP-9的表達以及腫瘤增殖有顯著的抑制作用[20]。本實驗使用不同濃度(0μM、10μM和50μM)的桑皮素干預卵巢癌SKOV3細胞，并采用MTT法對不同時間點(0h、24h和48h)的SKOV3細胞活性進行測定。發現給予桑皮素干預的卵巢癌SKOV3細胞活性呈濃度依賴性和時間依賴性下降，差異均存在顯著統計學意義(見表1)。該結果表明桑皮素對卵巢癌SKOV3細胞增殖有抑制作用。研究表明，桑皮素的抗腫瘤作用與其抑制STAT3磷酸化密切相關[19, 20]。Lim SL等在對前列腺癌的研究中證實桑皮素主要是通過抑制STAT3的活化下調了包括survivin、Cyclin D1、Bcl-2以及Bcl-xl等在內的多種腫瘤增殖重要分子的表達，并抑制腫瘤細胞增殖[19]。同時，Lin WL等的實驗也發現桑皮素對人肝癌SK-Hep1細胞的抑制作用也與調節STAT3的活化密切相關[20]。由于Cyclin D1在腫瘤細胞增殖調節過程中扮演著重要的角色，同時研究發現STAT3信號通路對其有關鍵的調控作用。本實驗中首先對Cyclin D1的表達進行分析，結果發現在給予卵巢癌SKOV3細胞不同濃度(0μM、10μM和50μM)桑皮素干預48h后，與未干預細胞相比較，給予桑皮素干預的細胞Cyclin D1 mRNA和蛋白表達水平呈濃度依賴性降低，差異均存在顯著統計學意義(P均<0.05) (圖1，表2)。進一步對STAT3的活化水平進行分析后發現與未干預細胞相比較，給予桑皮素干預后的SKOV3細胞STAT3磷酸化水平呈劑量依賴性降低，差異均有顯著統計學意義(P均<0.05) (圖2，表2)。該結果表明桑皮素可以有效的抑制卵巢癌SKOV3細胞Cyclin D1的表達和STAT3磷酸化水平。

4結論

本實驗表明，桑皮素可以通過抑制STAT3磷酸化顯著抑制卵巢癌SKOV3細胞的增殖并下調Cyclin D1的表達。為桑皮素應用于卵巢癌等惡性腫瘤的臨床治療奠定一定的理論基礎。

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(收稿日期：2015-04-14; 編輯： 陳舟貴)

通訊作者：鄧曉楊E-mail:dengxiaoyang2014@sina.com

基金項目：中國博士后科學基金(2014M552369);四川省醫學會科研課題(171140342)

【中圖分類號】R 737.32

【文獻標志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.01.005