哮喘小鼠CD4+ CD25+調節性T細胞及相關細胞因子的變化研究*

馬祥　劉洪　梁宗安　李群英

(1.成都市第一人民醫院呼吸內科， 四川 成都 610041；2.四川大學華西醫院呼吸內科， 四川 成都 610041)

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哮喘小鼠CD4+CD25+調節性T細胞及相關細胞因子的變化研究*

馬祥1劉洪1梁宗安2李群英1

(1.成都市第一人民醫院呼吸內科， 四川 成都 610041；2.四川大學華西醫院呼吸內科， 四川 成都 610041)

【摘要】目的探討哮喘小鼠 CD4+CD25+調節性 T 細胞(regulatory T cells，Treg) 及IL-10、TGF-β、IL-17水平的變化。方法30只雄性BALB/c小鼠被隨機分為三組：正常對照組、哮喘組及地塞米松組各10只；利用雞卵白蛋白腹腔注射、霧化吸入制備哮喘模型；取小鼠左肺組織作病理切片觀察炎癥改變；通過流式細胞儀檢測各組小鼠脾臟單個核細胞CD4+CD25+Treg細胞占CD4+T細胞的百分比；采用酶聯免疫吸附試驗檢測各組小鼠血清中細胞因子IL-1、TGF-β、IL-17表達水平。結果哮喘組小鼠的脾單個核細胞CD4+CD25+Treg細胞百分比以及IL-10、TGF-β的表達水平較正常對照組降低(P<0.05)，哮喘組IL-17的表達水平較正常對照組增高(P<0.05)，地塞米松組與正常對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。結論哮喘小鼠體內CD4+CD25+Treg數量的減少以及功能的下降、細胞因子IL-17表達的增加均參與了哮喘的發病過程。

【關鍵詞】哮喘; CD4+CD25+調節性 T 細胞; IL-10; TGF-β;IL-17

The expression of CD4+CD25+regulatory T cells,IL-10, TGF-β and IL-17 in asthmatic miceMA Xiang1, LIU Hong1,LIANG Zong’an2，etal

(1.DepartmentofRespiratory,TheFirstPeople’sHospitalofChengdu,Chengdu610041,China;

2.DepartmentofRespiratorydiseases,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

【Abstract】ObjectiveTo discuss the expression of CD4+CD25+regulatory T cells (Treg), IL-10, TGF-β and IL-17 in asthmatic mice. Methods30 male BALB/c mice were randomly assigned to the control group，the asthma group and the dexamethasone group. Tissues of left lung were obtained from mice to observe pathological changes．Flow cytometry was used to detect the percentage of CD4+CD25+Treg in CD4+T cells. The levels of serum IL-10，TGF-βand IL-17 were detected by ELISA. ResultsThe percentage of CD4+CD25+Treg, IL-10 and TGF-βin asthma group decreased significantly (P<0.05). The expression of IL-17 in asthma group increased significantly(P<0.05). The difference was not significant between the control group and the dexamethasone group (P>0.05).ConclusionThe number of CD4+CD25+Treg in asthmatic mice reduces, the function declines, and the increase of expression of IL-17 involves in the pathogenesis of asthma.

【Key words】Asthma; CD4+CD25+regulatory T cells; IL-10; TGF-β;IL-17

哮喘是一種復雜的氣道炎癥性疾病，以神經遞質、炎癥介質和吸入的收縮性刺激物導致支氣管過度收縮為特征。在T淋巴細胞亞群中，調節性 T 淋巴細胞(regulatory T cells，Treg)是其中的一類，它具有免疫抑制功能，能維持機體對自身抗原的免疫耐受，能預防自身免疫性疾病，在過敏性疾病中，能調節并避免過度的免疫反應，對機體具有非常重要的作用[1]。其中，CD4+CD25+Treg是Treg細胞的主要組成部分，它是自然存在于人體內的調節性T細胞, 在外周血CD4+T淋巴細胞中約占5%~10%。IL-10、TGF-β是由CD4+CD25+Treg分泌的兩種主要的細胞因子。Th17細胞是由CD4+初始T細胞經抗原活化，繼而分化，形成的一類功能獨立的T輔助細胞亞群。Th17細胞產生很多的細胞因子，如IL- 17、IL-22、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等，在一些自身免疫性疾病的發生發展中，這些細胞因子發揮著非常重要的作用[2]。近年來有研究發現，CD4+CD25+Treg以及Th17細胞通過多種途徑，介導了哮喘的發生發展過程。本研究以哮喘小鼠為對象，通過檢測哮喘小鼠體內CD4+CD25+Treg及IL-10、TGF-β、IL-17的表達情況，以探討哮喘發生過程中可能存在的免疫學機制。

1材料與方法

1.1實驗動物健康雄性BALB/c小鼠、體重20g左右、8周齡(四川大學華西醫學院動物實驗中心)，隨機分成3組：正常對照組、哮喘組、地塞米松組，每組分別10只。

1.2方法

1.2.1儀器與試劑主要實驗儀器：低溫高速離心機(德國Heraeus公司)；超聲霧化器(德國Boehringger Ingelhei)；CYTOMICS- FC500流式細胞儀(美國 BACK MAN COULTER 公司提供)。主要實驗試劑：雞卵蛋白(美國 Sigma 公司); 氫氧化鋁(天津三廠); 小鼠淋巴細胞分離液(天津TDB生物技術發展中心)；Anti-Mouse CD4 PE-Cy5、Anti-Mouse CD25 PE及相應同型對照等(美國eBioscience公司)。

1.2.2動物模型制備通過參照J.C. Kips[4]和Matthew E等[5]提出的方法，并適當加以調整來制備哮喘模型。正常對照組：分別在第1、8、14天腹腔注射生理鹽水0.5ml，第15天開始將小鼠置于密閉空間內，霧化吸入生理鹽水，一天一次，一次30分鐘，連續7天。哮喘組：分別在第1、8、14天腹腔注射預先制備的抗原液0.5 ml (含20μg 卵白蛋白、2.25 mg 氫氧化鋁)以致敏，第15天開始將小鼠置于密閉空間內，予1%卵白蛋白(OVA)霧化吸入激發，連續7天。地塞米松組:同樣使用腹腔注射抗原液使小鼠致敏，但在霧化吸入卵白蛋白前30分鐘腹腔注射地塞米松(2.5mg/kg)。

1.2.3分離脾單個核細胞在最后一次激發結束后，通過引頸的方式處死小鼠，取出脾臟，將其剪成多個小塊，并放在細胞篩上，進行研磨、過濾，制備脾單個核細胞的懸液，并調節細胞濃度為106個細胞/ml，最后使用流式細胞儀檢測各組CD4+CD25+Treg占CD4+T細胞的百分率。

1.2.4肺病理切片制備取出小鼠的左肺，使用10%中性甲醛固定24小時后，再進行常規脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，在HE染色后使用顯微鏡觀察各組小鼠肺組織形態、結構。

1.2.5血清IL-10、TGF-β、IL-17水平采用ELISA雙抗體夾心法測定IL-10、TGF-β、IL-17。嚴格按照試劑盒操作說明書進行檢測。

2結果

2.1各組肺組織病理哮喘組：在小鼠肺組織血管及氣管周圍，有大量淋巴細胞、嗜酸性細胞等炎性細胞浸潤，粘膜上皮存在不同程度的壞死、脫落。正常對照組：小鼠肺組織支氣管粘膜上皮、肌層完好，周圍無炎性細胞浸潤，支氣管管腔規則，形態基本正常。

2.2各組小脾單個核細胞CD4+CD25+Treg的百分率哮喘組小鼠脾單個核細CD4+CD25+Treg百分率，較正常對照組、地塞米松組明顯降低(P<0.05)；地塞米松組小鼠CD4+CD25+Treg百分率較哮喘組升高(P<0.05)；地塞米松組小鼠CD4+CD25+Treg百分率低于正常對照組小鼠，但兩組之間的差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1　各組小鼠脾單個核細胞 CD4+CD25+Treg百分率比較

注：與哮喘組比較①P<0.05，與正常對照比較②P>0.05

2.3血清IL-10、TGF-β、IL-17水平與正常對照組相比，哮喘組IL-10、TGF-β水平明顯減少(P<0.05)，IL-17水平明顯升高(P<0.05)；地塞米松組IL-10、TGF-β水平較哮喘組升高(P<0.05)、IL-17水平較哮喘組降低(P<0.05)；地塞米松組與正常對照組比較，IL-10、TGF-β水平稍低、IL-17水平稍高，但兩組之間的差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2　各組小鼠血清中細胞因子的水平±s)

注：與哮喘組比較 ①P<0.05，與對照比較②P>0.05

2.4相關性分析相關性分析表明：CD4+CD25+/CD4+與血清IL-10、TGF-β水平呈明顯正相關(r為0.352，P<0.05)；CD4+CD25+/CD4+與IL-17水平呈負相關(r為-0.279，P<0.05)；IL-10、TGF-β水平與IL-17呈負相關(r為-0.162，P<0.05)。

3討論

支氣管哮喘是一類慢性肺部炎癥性疾病，其發生過程中以嗜酸性粒細胞浸潤為主，由多種免疫細胞和細胞因子參與其中。近年來的研究表明，在哮喘的發病機制中，CD4+CD25+Treg起著極為重要的作用。CD4+CD25+Treg通過多種途徑和方式實現其作用，可以通過細胞之間的直接接觸，也可以通過分泌細胞因子IL-10和TGF-β對局部免疫反應產生抑制作用[5]。有研究認為，與哮喘的發生、發展可能與體內CD4+CD25+Treg的數量或功能異常有關。但是，關于哮喘患者體內外周血CD4+CD25+Treg水平是升高還是降低，報道是不一致的，大部分的意見是哮喘患者外周血CD4+CD25+Treg水平是降低的，這些研究認為，CD4+CD25+Treg數量的不足，會導致其免疫抑制功能的下降，從而，可能會出現對Th2細胞的抑制作用的減弱，使Th2類型的免疫反應增強，以至產生的大量的致炎因子，如 IL-4，IL-5和IL-13等，導致哮喘的發作[6-8]。但是，也有少數研究發現，哮喘患者外周血CD4+CD25+Treg水平與正常對照組比較，并沒有表現出明顯的差異，甚至其數量是升高的。

CD4+CD25+Treg分泌多種細胞因子，其中，IL-10和TGF-β是其發揮免疫抑制作用的主要細胞因子。IL-10可以阻止T細胞受體介導的CD4+T細胞的活化，抑制氣道內的炎癥，抑制諸炎癥細胞，如嗜酸性粒細胞、肥大細胞等的激活，抑制炎性細胞因子的釋放，實現其調節機體免疫功能，因此，又稱為細胞因子合成抑制因子。當體內IL-10的水平降低，機體的免疫抑制功能會減弱，在氣道，會出現過敏性炎癥反應，當接觸到外界的過敏原刺激時，氣道會出現反應增強。有研究顯示，在哮喘小鼠體內，IL-10水平較正常小鼠低，提示IL-10可能在哮喘中發揮抑制作用。研究報道，CD4+CD25+Treg與活動性哮喘相關，CD4+CD25+Treg可以通過分泌IL-10，減輕氣氣道急性過敏性炎癥，減輕氣道的高反應性，并且延緩氣道的重塑[9]。TGF-β可通過抑制IL-1 和IL-2的釋放直接抑制T細胞的增殖和分化，也抑制B細胞增殖，抑制巨噬細胞的增殖及活性氧釋放功能，以抑制炎癥反應，減輕氣道的免疫反應，減輕氣道炎癥。而且，TGF-β可使Treg具有穩定的免疫抑制功能，在維持Tregs的功能的同時也促進適當的Tregs分化。Scherf W等研究者們發現[10]，TGF-β基因敲除的小鼠，炎癥反應明顯增強，對過敏原的刺激反應強烈，而全部敲除了TGF-β基因的小鼠，會因強烈的炎癥反應出現快速死亡。有研究顯示，在氣管中，TGF-β不僅能夠直接抑制抗原誘導的炎癥反應以及氣道高反應性，并且，在抗原刺激后，肺泡上皮細胞也可以通過TGF-β途徑，直接誘導Treg細胞上Foxp3+的表達，從而促進CD4+CD25-Treg細胞轉化為CD4+CD25+Treg，以調節肺黏膜的免疫應答，實現對外界抗原產生免疫耐受[11]。在本研究中，哮喘組小鼠CD4+CD25+Treg百分率、IL-10、TGF-β水平均呈現顯著的降低，CD4+CD25+Treg與IL-10、TGF-β呈正相關的關系，與國內外大多數的研究結果相一致，支持CD4+CD25+Treg可能通過分泌細胞因子IL-10、TGF-β來發揮其免疫抑制作用，IL-10、TGF-β水平的降低，可能促進了哮喘小鼠氣道內過敏性炎癥反應，導致哮喘的發生。在地塞米松組，CD4+CD25+Treg百分率、IL-10、TGF-β明顯升高，提示地塞米松可能通過上調CD4+CD25+Treg數量、促進其分泌相關抑制性細胞因子以發揮其抗炎作用。

Th17細胞和Tregs都屬于T細胞亞群。近年來研究發現，Th17細胞可以通過多種途徑來介導組織細胞的免疫損傷。Th17細胞主要分泌IL-17和IL-23等炎癥因子。IL-17是Thl7細胞的主要的效應因子，它也是近年來新發現的諸多炎癥因子中的起始因子，它可以促進炎性細胞釋放炎性因子，可誘導T細胞的產生、增強炎癥反應，還可以在氣道炎性反應的過程中，招募中性粒細胞的聚集，進一步促進多種炎癥細胞釋放出炎性因子，從而加重氣道的阻塞，增強氣道的高反應性[12]。在過敏性哮喘患兒的肺組織、痰液、血清、肺泡灌洗液及外周血中，IL-17均顯著升高[13]，并且，其表達水平的高低，與患者氣道高反應的嚴重程度呈現密切的相關性[14]。在一系列針對IL-17和IL-17R基因敲除小鼠的研究中，發現在過敏性哮喘的致敏階段，IL-17能夠誘導Th2的活化，能夠使嗜酸性粒細胞聚集，促進IgE的產生，導致氣道的炎癥以及重塑[15]。近期的研究發現，CD4+CD25+Treg與Th17細胞之間關系緊密，二組在分化上互相影響，在功能上有表現出相互拮抗，從而，使機體的免疫狀態呈現出相對穩定，對機體免疫平衡狀態起著非常重要的作用。活化的CD4+T細胞在TGF-β作用下分化為抗炎的CD4+CD25+Treg，但是，活化的CD4+T細胞在TGF-β和高濃度IL-6 都存在的情況下，則分化為具有促炎作用的Th17細胞，表現出抑制CD4+CD25+Treg的分化。CD4+CD25+Treg能夠通過分泌TGF-β細胞因子，促進Th17細胞的發育。在缺乏外源性TGF-β，但是，有IL -6存在的情況下, CD4+CD25+Treg本身也可以分化為Th17細胞，反之，抑制Th17細胞的產生可促進CD4+CD25+Treg的發育[16]。本研究結果顯示，哮喘小鼠CD4+CD25+Treg百分率及其細胞因子IL-10、TGF-β較正常對照組顯著降低，同時，Th17細胞因子IL-17顯著增高，并且，CD4+CD25+Treg與IL-10、TGF-β表達水平呈正相關，與IL-17之間呈負相關關系，提示在哮喘小鼠體內，在CD4+CD25+Treg數量和功能的下調的同時，也出現了IL-17表達增加，表現出免疫失衡狀態。地塞米松干預后的小鼠CD4+CD25+Treg數量及相關細胞因子IL-10、TGF-β明顯升高，而IL-17水平呈現明顯降低，提示地塞米松可能會促進CD4+CD25+Treg及相關因子的表達，能夠抑制TH17相關細胞因子的表達，以實現調節CD4+CD25+Treg/Th17之間的免疫失衡狀態，從而抑制機體的炎癥反應，表現出其抗炎作用。

4結論

本研究結果顯示，哮喘小鼠體內存在CD4+、CD25+Treg數量的減少以及IL-10、TGF-β表達水平的下降、細胞因子IL-17表達的增加。CD4+、CD25+Treg及其相關細胞因子IL-10、TGF-β、TH17類細胞因子IL-17，共同介導的免疫平衡參與了哮喘的發生、發展過程，地塞米松可能通過調節這些細胞及其細胞因子平衡來發揮其抗炎作用。引起支氣管哮喘的機制復雜，并且參與的因素眾多，糖皮質激素及CD4+、CD25+Treg介導哮喘發病的具體作用機制卻并不清楚，還需要進一步的研究。對哮喘免疫機制的深入研究將有助于為哮喘的治療提供更有效的方法。

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(收稿日期：2015-09-02； 編輯： 陳舟貴)

通訊作者：梁宗安，教授，本刊常務編委，E-mail:liang.zongan@163.com

基金項目：國家自然科學基金(30871119)

【中圖分類號】R 562.2+5

【文獻標志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.01.004