糞便中miRNA-424在結直腸癌診斷和篩查中的應用

許安東, 朱云祥, , 湯曉飛, 王光輝

(1. 揚州大學第二臨床醫學院 普外科, 江蘇 揚州, 225000;

2. 上海交通大學附屬新華醫院 結直腸外科, 上海，200092)

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糞便中miRNA-424在結直腸癌診斷和篩查中的應用

許安東1, 朱云祥1, 2, 湯曉飛1, 王光輝2

(1. 揚州大學第二臨床醫學院 普外科, 江蘇 揚州, 225000;

2. 上海交通大學附屬新華醫院 結直腸外科, 上海，200092)

摘要:目的研究miRNA(miR-150, miR-424，miR-29b，miR-96)在結直腸癌組織和糞便中的表達情況。方法納入77例結直腸癌患者以及43名正常志愿者。運用實時定量PCR技術，對miRNA在結直腸癌患者與正常人群的糞便中的表達情況進行檢測，并比較二者的差異。結果 miR-150在正常人群和結直腸癌患者糞便中表達有顯著差異(P<0.05); miR-424在正常組中的表達量顯著低于腫瘤組(P<0.05)。miR-29b和miR-96在兩種人群糞便中的表達量無顯著差異(P>0.05)。miR-424的曲線下面積為0.756，而miR-150的曲線下面積為0.661。結論miR-424在結直腸癌患者和正常人群的糞便中表達存在明顯差異。

關鍵詞:microRNA; 結直腸癌; 腫瘤標志; 診斷

結直腸癌作為世界上最常見的3種惡性腫瘤之一，也是腫瘤相關性死亡的主要原因[1]。盡管結直腸癌根治術已經大大降低腫瘤的死亡率，但是腫瘤的晚期轉移和復發仍然是患者死亡的主要原因。結直腸癌早期癥狀不明顯，患者診斷腫瘤往往已是中晚期，延誤了腫瘤的治療[2]。所以早期篩查和診斷是降低結直腸腫瘤死亡率和提高患者預后的重要措施[3]。

目前已有一些檢驗方法和蛋白標記物用于檢測早期結直腸癌，如糞便隱血試驗、癌胚抗原(CEA)、CA125、CA19-9等。但是這類檢驗方法以及蛋白標記物的敏感性不強，無法達到檢測早期腫瘤的目的[4-5]。結腸鏡和病理檢查是當前診斷結直腸癌的金標準，根據臨床指南，其適用于50歲甚至更高年齡的人群[6]。由于結直腸鏡檢查前需要做腸道準備，可能會造成被檢者的不適，以及費用較高等因素，并沒有在發展中國家得到廣泛的使用[7-8]。影像學檢查如CT和MRI都是非常有效和非侵入性的檢查，但是輻射、高費用以及對早期腸道腫瘤的檢出率低影響了其在篩查結直腸癌中的應用[9]。

MicroRNA是一類由18～25個核苷酸組成的非編碼RNA家族，參與調控近1/3的人類基因，影響細胞的增殖、遷徙、轉移、凋亡等功能。它的異常表達在多種腫瘤中得到證實，包括結直腸癌[10-11]。Ahmed等[12]在5位正常志愿者和15位腸癌患者的糞便中發現，miR-21、miR-203、miR-20a、miR-326、miR-92等在腫瘤患者的糞便中表達上調，而miR-320、miR-126、miR-484-5p、miR-145、miR-16、miR-125b等則相反。在作者前期的篩查中發現，miR-150在正常組織中的表達量比腫瘤組織高，而miR-106b，miR-96和miR-424在腫瘤組織中的表達相對于正常組織明顯升高[13]。由此作者設想，糞便中這4種miRNA在腫瘤患者和正常人群糞便中的表達量可能存在差異，并且有望成為一類非侵入性腫瘤標記物來篩查和診斷結直腸癌。

1材料與方法

1.1糞便標本

本次研究中，作者納入了新華醫院結直腸癌診治中心77例結直腸癌患者以及43例正常志愿者，收集其糞便標本。排除患有炎癥性腸病、腹瀉、腸道功能紊亂以及曾接受過腸道手術、放化療的患者。本實驗通過了新華醫院倫理委員會，每位參與者都簽訂了知情同意書。

1.2總RNA的提取及RT-PCR

使用Omega 糞便RNA提取試劑盒(R6828-01)提取所有參與試驗的志愿者糞便中的總RNA, 用Biotend試劑盒進行一步法熒光定量PCR, 引物序列為hsa-miR-150: UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG；hsa-miR-29b: GCUGGUUUCAUAUGGUGGUUUAGA；hsa-miR-96: UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU; hsa-miR-424：CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA。U6選作該實驗的內參，引物均由上海拓然生物公司合成，采用相對表達量評估基因表達水平，采用2-△△Ct法計算。

1.3統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件，運用非參數獨立樣本t檢驗對比miRNA的表達差異,P<0.05為差異有統計學意義；圖表均使用Graphpad 5.0制作。

2結果

采用熒光定量PCR對所有參與該實驗的120例志愿者糞便中miRNA相對表達量進行分析，包括77例腫瘤患者和43例正常志愿者。腫瘤患者中男40例，女37例；年齡<60歲53例，≥60歲24例；直腸癌36例，結腸癌41例；患者優8例，良67例，差2例；腫瘤大小為≤3 cm者25例，3～5 cm者23例，≥5 cm者29例；腫瘤分期T1者3例，T2者15例，T3者40例，T4者19例；淋巴轉移N0者26例，N1者30例，N2者21例；遠處轉移M0者64例，M1者13例；疾病分期Ⅰ級11例，Ⅱ級13例，Ⅲ級41例，Ⅳ級13例。

作者發現miR-150在腫瘤患者糞便中的表達量明顯要低于正常志愿者(P<0.05), miR-424在腫瘤患者糞便中的表達量相對于正常志愿者明顯升高(P<0.05), 但是miR-29b和miR-96在腫瘤患者和正常志愿者糞便中的表達無顯著差異(P>0.05)。見圖1。

運用ROC曲線法進一步分析數據發現, miR-424和miR-150的曲線下面積(AUC)為0.756(標準誤為0.047,P<0.001)和0.661(標準誤為0.049,P=0.001)。另外, miR-424對結直腸癌的診斷具有69.94%的敏感性和74.42%的特異性，而miR-150的特異性和敏感性為72.5%和54.5。見圖2。

3討論

結直腸腫瘤是全世界最常見的腫瘤之一，其發病機制尚不完全清除，目前最有效的治療還依賴于結直腸腫瘤切除[14-18]。盡管根治性切除已經大大降低了結直腸癌的死亡率，但是晚期的復發與轉移依舊是腫瘤患者死亡的主要原因[19-21]。由于結直腸癌早期癥狀不明顯，往往使得很多患者失去了早期治療的機會，所以早期診斷成了預防和治愈結直腸癌的重要環節[22-24]。

目前許多檢查如血清指標、腸鏡檢查以及一些先進的影像學檢查，由于準確率不高，敏感性不強以及價格較昂貴等原因，不適用于早期結直腸癌的篩查和診斷[24-26]。另外一些分子生物指標出現，并有望用于結直腸癌的早期診斷，例如血清中miRNA等也起到了預測結直腸癌的目的，但是血清中這類指標穩定性較差。相比較而言，糞便中的miRNA的穩定性和提取難易程度要優化很多[25]。

A: miR-150在CRC患者糞便中表達量明顯比正常志愿者低; B: miR-424在CRC患者糞便中表達量明顯比正常志愿者高；

圖2miR-150和miR-424的ROC曲線分析

關于miRNA作為生物指標預測結直腸癌的相關報道并不是很全面。有研究[26]通過檢測糞便中miRNA發現，miR-135b在正常志愿者、腺瘤以及結直腸癌患者糞便中的表達量呈現遞增趨勢。miR-150具有抑制結直腸腫瘤生長的作用，其表達下調與結直腸腫瘤的發生發展息息相關[27], miR-424具有促進結直腸癌腫瘤發生發展的作用[28]。本研究結果顯示，miR-150在結直腸癌患者糞便中的表達量明顯比正常志愿者低，而miR-29b和miR-96在二者糞便中的表達量無顯著差異。另外運用曲線下面積(AUC)分析miR-150和miR-424對結直腸癌的預測效果發現，二者的曲線下面積分別為0.756和0.661，miR-424對結直腸癌診斷的敏感性為69.94%，特異性為74.42%，而miR-150的特異性和敏感性為72.5%和54.5。AUC>0.5時，AUC越靠近1, 診斷效果越好。AUC在 0.5～0.7時準確性較低，AUC在0.7以上時準確性較好。

通過本次實驗作者發現，miR-424在結直腸癌患者糞便中的表達量相比于正常患者上調明顯，與腫瘤組織中miR-424表達高于正常組織的趨勢一致，證明miR-424有望成為結直腸癌早期篩查和診斷的腫瘤標志物。由于miR-150對結直腸癌的診斷準確性較低，不適用于早期診斷和篩查。

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Application of fecal miRNA-424 in screening and diagnosis of colorectal cancer

XU Andong1, ZHU Yunxiang1, 2, TANG Xiaofei1, WANG Guanghui2

(1.DepartmentofGeneralSurgery,TheSecondSchoolofClinicalMedicineofYangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu, 225001; 2.DepartmentofColorectalSurgery,XinhuaHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai, 200092)

ABSTRACT：ObjectiveTo investigate the expressions of miRNA (miR-150, miR-424, miR-29b, miR-96) in the tissues of colorectal cancer (CAC) and feces. MethodsA total of 77 patients with CRC and 43 healthy volunteers were selected, and the real-time PCR method was used to evaluate the miRNA expression in the feces of the patients with CAC and healthy volunteers. ResultsSignificant difference of the miR-150 expression was found between the feces of patients with CRC and healthy volunteers (P<0.05), and miR-424 expression in the normal group was significantly lower than the tumor group (P<0.05). There were no significant differences in expressions of miR-29b and miR-96 between the patients with CAC and healthy volunteers (P>0.05). The area under the curve (AUC) of miR-424 was 0.756, and 0.661 for miR-150. ConclusionThere is significant difference of miR-424 expression between the feces of the patients with CAC and healthy volunteers.

KEYWORDS:microRNA; colorectal cancer; biomarker; diagnosis.

通信作者:朱云祥

基金項目:中國博士后科學基金面上資助項目(2012M510859)

收稿日期:2015-10-23

中圖分類號:R 735.3

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)01-016-04

DOI:10.7619/jcmp.201601005