NF-κB信號通路研究進展＊

趙運旺，朱嘉寧

（西北師范大學生命科學學院，甘肅 蘭州730070）

NF-κB信號通路研究進展＊

趙運旺，朱嘉寧△

（西北師范大學生命科學學院，甘肅 蘭州730070）

轉錄因子NF-κB作為一個標準的可誘導的轉錄因子已經超過20年了。眾多的可激活NF-κB的刺激，以及大量的受NF-κB調節的基因，確保了這一轉錄因子仍然是研究熱點。在這里，我試圖總結一下從這些NF-κB的研究中所浮現出的一些基本規律，并希望能找出一個較統一的關于NF-κB調節的觀點。

NF-κB；信號通路；家族蛋白

1 NF-κB信號通路概述

NF-κB(nuclear factor-κB)是一種細胞核轉錄因子,因其能夠與B細胞免疫球蛋白的κ輕鏈基因的增強子κB序列GGGRNWYYCC(N-任意堿基; R-嘌呤;W-腺嘌呤或胸腺嘧啶;Y-嘧啶)特異結合而得名[1-3]。NF-κB 調控一大類基因的表達,它調控的靶基因包括免疫相關受體、細胞因子(如IL-1、IL-2、IL-6、IL-12和TNF2α、LTα、LTβ、GM-CSF)、炎癥因子 (IL-8、MIP-1α、MCP1)、黏附分子(ICAM、VCAM和E-selectin)、急性期蛋白(如SAA)等,在調控免疫細胞的激活、T、B淋巴細胞的發育、細胞凋亡、腫瘤形成、病毒復制、炎癥反應及多種自身免疫性疾病方面發揮重要作用[4-5]。

NF-κB信號轉導通路屬于受調蛋白水解酶依賴的受體信號轉導通路。在未受刺激的細胞中，NF-κB轉錄因子與抑制性I?B(InhibitorofkappaB)蛋白結合在一起，因而被滯留在細胞質中。上游信號的刺激導致IκB蛋白在IKK(IκB kinase)的作用下被磷酸化修飾，繼而被泛素連接酶復合體識別，促使IκB蛋白以蛋白酶體依賴的方式被降解，NF-κB從而被釋放出來，進入細胞核并啟動靶基因的表達。

2 NF-κB信號通路的主要成員

2.1 NF-κB家族蛋白

NF-κB家族成員主要包括RelA(p65),c-Rel, RelB,NF-κB1(p50蛋白及其前體p105)和NF-κB2 (p52蛋白及其前體p100),各成員可形成同源或異源二聚體而行使功能。在哺乳動物細胞中最常見的是NF-κBp65與p50結合形成p65/p50二聚體。NF-κB家族蛋白的共同點是均含有一個高度保守的由大約300個氨基酸組成的結構域—Rel同源結構域（Relhomologydomain，簡稱RHD），該結構域與DNA結合、蛋白二聚化以及與IκB蛋白結合等功能有關。RHD 同時還含有核定位信號序列（nuclear localization signal，簡稱NLS），是活化的NF-κB進入細胞核所必需的，在細胞質中NF-κB與IκB蛋白結合，IκB掩蔽了NF-κB的NLS，使NF-κB滯留在胞質內，當IκB被降解后，NF-κB的NLS暴露，使NF-κB進入核內并與靶基因結合。不同的是RelA (p65),c-Rel,RelB的C端含有一個轉錄激活結構域（transactivationdomain，簡稱TAD），可以通過募集轉錄共激活物和移除轉錄阻礙物而促進轉錄；而NF-κB1和NF-κB2的C端則為多拷貝的錨蛋白重復序列（ankyrin repeats），該重復序列可以與RHD結構域結合，從而通過掩蔽核定位序列（NLS）抑制蛋白的入核，此外，NF-κB1和NF-κB2的前體蛋白可以通過有限剪切等方式轉變成短的、有活性的蛋白形式。p52和p50的同源二聚體缺少TAD，因此沒有真正的能力去驅使轉錄，事實上，在靜息細胞中，p52和p50的同源二聚體抑制基因轉錄，但p52和p50可以通過與含TAD的NF-κB蛋白形成異源二聚體而起始轉錄。

通過遺傳學實驗的研究，我們對NF-κB家族蛋

白的功能有了更精確的了解，這些主要是通過基因敲除實驗得到的，現在幾乎所有的NF-κB家族成員的基因敲除小鼠都已經被報道，下面分別介紹NF-κB家族蛋白各個成員的功能。

遺傳學研究顯示p65在TNFα引起的細胞凋亡中起到關鍵性的保護作用。P65-/-小鼠在胚胎發生期E14-E15時，由于TNFα誘導大量發育中的肝細胞發生凋亡而死亡。P65-/-TNFα-/-或p65-/-TNFR-/-雙敲除的小鼠在TNFα誘導下沒有出現大范圍的肝細胞凋亡，仍然可以正常發育，可以研究在其它組織中p65敲除的影響。但p65-/-TNFR-/-雙敲除的小鼠對細菌感染的易感性增強，所以出生后死亡率很高，這也提醒我們注意p65在固有免疫應答中的作用和由非造血系統細胞起始的固有免疫應答。除了抑制TNFα介導的肝細胞的凋亡之外，p65還能保護很多其他類型的細胞免受TNFα的毒性影響，包括巨噬細胞、B細胞、和T細胞。同時，p65的抗凋亡的功能也不僅局限于對TNFα刺激的應答，有研究表明p65也可以保護雙鏈RNA（dsRNA）引起的細胞死亡[6]。P65的抗凋亡功能與它能夠誘導許多抑制凋亡的靶基因表達有關，包括c-FLIP、cIAP1、cIAP2、A20、GADD45β和MnSOD等[7]。此外在嵌合鼠模型中，p65的敲除實驗還顯示出其在各種刺激下的B細胞和淋巴細胞增殖時的類別轉換中發揮重要作用。

p50蛋白是由 NFKB1基因編碼的，并通過p105前體蛋白剪切而成。p105蛋白轉變成p50蛋白的過程似乎是細胞中持續發生的，從而可以提供充足且成熟的p50亞基，并與其它NF-κB家族蛋白形成二聚體[8]。p105蛋白通過限制性的蛋白酶水解產生p50的過程，依賴于一個在氨基酸376～404之間的甘氨酸富集區（GRR），它是一個蛋白水解的終止信號。與p65敲除小鼠不同，p50缺失小鼠沒有任何發育缺陷。p50-/-小鼠表現出免疫球蛋白產量下降并存在體液免疫應答缺陷。

p52/p100蛋白是由NFKB2基因編碼的，p52蛋白來自于p100蛋白誘導后剪切的N端部分，它是與RelB形成異源二聚體的主要亞基。p100蛋白被剪切成p52蛋白是受上游信號嚴格調控的，只有在某些特定的刺激下（如某些TNFR家族蛋白的激活）才會發生，在未受刺激的細胞中僅有極少的p100的組成型加工處理。p100的加工處理過程首先是由NIK（NF-κB-inducing kinase）活化IKK(IκB kinase) α，激活的IKKα促使p100的磷酸化，從而募集SCFβTrCP，導致p100的Lys855的多聚泛素化，再經過蛋白酶體的剪切產生成熟的p52蛋白。有研究顯示在此過程中，NIK不僅是IKKα的激酶而且是一個連接IKKα和p100的對接蛋白。此外，p100的C端死亡區（DD）可能是一個加工處理過程的抑制區，缺失此區的p100表現出增加的組成型加工處理。同p105，p100的GRR區對于部分處理產生p52和釋放活化的p52：NF-κB復合體也是必需的。p52-/-小鼠不能正常發育出B細胞囊泡、生發中心并且脾的結構和派伊爾結（Peyer’spatches）的發育有缺陷[9-11]，此外還表現出不正常的T細胞功能。類似的免疫系統缺陷也發生在缺失淋巴毒素β（lymphotoxinβ，簡稱LTβ）、淋巴毒素β受體（lymphotoxinβreceptor,簡稱 LTβR）、NF-κB誘導激酶 （NF-κB-inducing kinase，簡稱NIK）或RelB的小鼠中[12]。上述結果表明，這些基因的表達產物可能共同參與LTβR誘導的信號途徑。總之，p52敲除小鼠的表型與p52在LTβR誘導的信號途徑中的作用一致，尤其是與次級淋巴器官的發育有關。

RelB的獨特之處在于不能形成同源二聚體，也不與c-Rel或p65形成異源二聚體，它僅與p100，p52，p50形成異源二聚體，且除了與p100相互作用外不與其它I-κB蛋白作用。只有胸腺、淋巴結和派伊爾結（Peyer’s patches）的特定區域才能檢測到RelB的大量表達。與它的表達分布一致的是，RelB的主要功能是促進次級淋巴結構的形成和調節免疫應答中某些類型細胞的發育和功能。研究表明，RelB:p52二聚體表現出組成型的核定位，而且RelB參與多種組織中NF-κB的組成型激活。RelB-/-小鼠的胸腺和脾臟細胞中表現出NF-κB活性的下降，并且使多種器官中的炎性浸潤增強，適應性免疫應答也有嚴重缺陷，如果p50也敲除，這種表型會更加明顯，這表明p50和RelB共同調節限制炎癥的基因的表達。各種研究顯示，RelB對于淋巴器官的發生很重要，尤其是派伊爾結的發育，這些發現使人們開始關注RelB：P52在淋巴器官發生中的作用（很可能是通過LTβR信號通路）。

c-Rel可以形成同源二聚體，也可以與p65或p50形成異源二聚體。c-Rel-/-小鼠不能產生有價值的體液免疫應答，并且外周的T、B細胞對典型的抗原刺激不應答。缺少c-Rel的TAD區，但有完整的

RHD區的小鼠表現出更嚴重的表型，如次級淋巴器官顯著增生和骨髓增生。表明c-Rel對機體的免疫調節可能具有重要的作用。

以上主要通過基因敲除的研究結果討論了NF-κB各亞基蛋白的功能，但是由于NF-κB各亞基之間可能具有功能上的重疊性以及相關性，所以單獨敲除一個亞基的基因可能不能完全表現出該基因的功能。多亞基敲除的實驗可以幫助我們更深入地研究NF-κB轉錄因子的功能，并且已有研究表明，多亞基缺失的小鼠確實表現出新的表型或者更加嚴重的病理癥狀[12]。

2.2 IκB家族蛋白

NF-κB抑制因子(InhibitorofkappaB,I-κBs)是一類NF-κB抑制蛋白,其中包括IκBα、IκBβ、IκBλ、IκBε、IκBNS、Bcl-3、IκBζ以及果蠅的Cactus蛋白等亞基，它們的分子中都含有五到七個在進化上很保守的錨蛋白重復序列，該重復序列可以通過與NF-κB的RHD結構域結合，掩蔽NF-κB的核定位序列，從而使NF-κB滯留在胞質中。另外，IκB家族中還包括一些不具有抑制NF-κB活化功能的蛋白，如Bcl-3和IκBζ等。下面分別介紹一下各亞基的功能。

靜息狀態下IκBα通過與NF-κB轉錄因子的結合掩蔽了NF-κB二聚體的核定位信號，同時也干擾了NF-κB與DNA的結合，從而阻抑了NF-κB的轉錄功能。NF-κB信號通路可被多種外來信號如TNFα、生長因子、細胞因子、淋巴因子、紫外線、藥物、壓力等激活。在外來信號的作用下,IκBα蛋白N端的兩個保守的絲氨酸Ser32和Ser36被IKKβ磷酸化，繼而被SCFβ-TrCPE3泛素連接酶復合體識別，從而促使IκBα分子中的Lys21及Lys22位點被泛素化修飾，并被26S蛋白酶體識別和快速降解。NF-κB被釋放出來并進入細胞核，與特定基因的啟動子區域結合，從而啟動靶基因的轉錄。IκBα-/-小鼠表現出增強的NF-αB的DNA結合活性，但并不是組成性的，說明p65:p50二聚體可能還受到其它機制的調控。新合成的IκBα參與反饋調節從而阻止NF-κB的進一步激活，與此一致，IκBα-/-小鼠在TNF-α刺激下的NF-κB信號通路的結束顯著推遲。

IκBβ和IκBε的功能與IκBα相似，只是與不同的NF-κB二聚體的親和力不同，而且它們也受蛋白N端位點的磷酸化調控，如IκBβ的絲氨酸Ser19和 Ser23被IKKβ磷酸化，但是磷酸化和降解的動力學反應比IκBα要慢得多，可能是由于上游IKK激酶復合物與底物IκB的親和力差異等原因造成的。研究顯示，IκBε含有一個非經典的NES，是c-Rel和IκBε返回胞質所必需的，而且由于IκBε是在NF-κB激活后誘導的，因此它可能在調節NF-κB晚期基因的激活方面起一定作用。

Bcl-3和IκBζ與經典的IκBs蛋白不同，而且與其他IκBs的同源性很差。Bcl-3可能作為共激活因子與p50（或p52）同源二聚體特異性結合，形成轉錄激活復合體，促進轉錄，解除p50（或p52）同源二聚體的抑制作用。Bcl-3-/-小鼠可存活，但對于各種病原體無法產生合適的體液免疫應答，它們缺少脾生發中心，但血清抗體水平正常，并且無抗原特異性應答，表型部分與p52-/-相似，也支持了Bcl-3與p52同源二聚體結合形成轉錄激活復合體，IκBζ可能促進一系列NF-κB靶基因（如IL-6等）的活化[13]，但沒有其它直接證據證明它是IκB家族的有功能的成員，并且未顯示其與Rel家族成員相互作用。

2.3 IKK蛋白

IKK(IκBkinase)，它可以使NF-κB的抑制者IκB磷酸化，隨后引起IκB的泛素化和蛋白酶的降解，釋放和活化NF-κB。IKK主要以IKK復合體的形式發揮作用，IKK復合體主要包括IKKα（IKK1）、IKKβ（IKK2）和NEMO（NF-κBessential modulator，也叫IKKγ、IKKAP1、Fip-3），其中IKKα和IKKβ是催化亞基，NEMO是調節亞基。IKKα、IKKβ是一類絲/蘇氨酸激酶，N端含一個蛋白激酶結構域，C端是螺旋-環-螺旋結構域 （HLH）和亮氨酸拉鏈結構域（LZ），NEMO是一個分子量約為48KDa的蛋白，與IKKα、IKKβ不同，它的N端和C端含有大量的卷曲螺旋結構（CC），C端還有一個鋅指樣結構域（ZF）和一個亮氨酸拉鏈結構域（LZ）。IKKα、IKKβ的二聚化依賴于LZ結構域，而且此結構域對于其的激酶活性也有貢獻。HLH結構域對于IKK的激活是必須的，而且它和IKK激酶活性的負調控有關。IKKα、IKKβ與NEMO的作用是通過C端的六肽序列（Leu-Asp-Trp-Ser-Trp-Leu），即 NBD（NEMO binding domain）實現的。NEMO也能通過其CC和LZ結構域形成多聚體，主要是三聚體或四聚體。由于 IKK復合體中存在兩個 IKKα/IKKβ二聚體，NEMO很可能是以四聚體的形式存在的。組裝IKK

復合體時，NEMO通過其N端的CC結構域與IKKβ的C端的NBD結構域結合，而且有研究顯示，移除HLH結構域，IKK與NEMO無法結合，這說明HLH結構域可能促進IKK與NEMO的裝配。IKKα和IKKβ的序列具有很高的同源性，其全部序列有52%的同源性，催化區有65%的同源性。IKKα、IKKβ和IKKγ的蛋白分子量總和約為220kDa，但IKK復合體的分子量約為700～900KDa，這說明IKK復合體中還有其他組分，或IKK復合體中的亞基以聚合體的形式存在。下面分別介紹一下IKK復合物各亞基的功能。

IKKβ亞基主要在TNF、IL-1和LPS等誘導的促炎反應信號通路中行使磷酸化IκB蛋白的功能，是IKK復合物的主要的催化亞基，而且是快速激活NF-κB所必需的。IKKβ能特異地磷酸化IκBα、IκBβ和IκBε分子中特定的Ser殘基。以IκBα為例，IKKβ活化后將IκBα的Ser32和Ser36兩個位點磷酸化，IκBα隨即被E3泛素連接酶識別并導致26S蛋白酶體依賴的降解，從而使NF-κB二聚體被釋放并活化，這條信號轉導途徑叫做NF-κB激活的經典信號途徑。IKKβ-/-小鼠由于肝細胞發生凋亡，在胚胎發育的E12.5-E14.5天時死亡，這與p65-/-及p65-/-p50-/-基因敲除小鼠的表型一致。IKKβ-/-細胞比野生型細胞對TNFα誘導的凋亡更加敏感，而且TNFα、IL-1和dsRNA等刺激不能誘導IKKβ-/-細胞中NF-κB的活化。IKKβ+/-細胞中IKKβ的表達量降低了一半，導致IKK的激酶活性降低了～50%，NF-κB的活性則降低了～70%～80%。IKKβ-/-TNFR-/-雙敲除小鼠在細菌感染的固有免疫應答中存在明顯缺陷，出生后僅存活幾天，但p65-/-TNFR-/-雙敲除小鼠可存活數月，這說明IKKβ的作用不能被IKKα或其它激酶補償。以上結果都表明IKKβ是固有免疫和炎癥反應等過程中激活NF-κB所必需的蛋白激酶，主要在NF-κB的經典途徑中發揮作用。

雖然IKKα和IKKβ的的序列有很高的相似性，但是它們在功能上卻有很大的不同。IKKα-/-小鼠在出生后4小時就由于多種形態缺陷而死亡，尤其是表皮和骨骼的發育存在明顯缺陷。與IKKβ-/-小鼠不同，IKKα-/-小鼠中沒有發現肝細胞的凋亡，而且在IKKα-/-小鼠的胚胎成纖維細胞、原初上皮細胞和肝細胞中，TNFα、IL-1和LPS的刺激均能誘導正常的IKK復合物的活化和IκB的降解，表明IKKα不是固有免疫和炎癥反應中NF-κB活化所必需的，而可能在發育過程中有重要作用，因為新生的IKKα-/-小鼠表現出缺乏四肢、尾巴和耳朵，顱面部發育失常，皮膚光滑緊繃，上皮的形成和構造明顯異常等表型。研究發現，IKKα的激酶失活突變體IKKα(AA)（IKKα的激酶區的兩個絲氨酸突變為丙氨酸）能夠阻斷NIK誘導的p100的剪切作用；反之，過量表達持續激活的IKKα（EE）（IKKα的激酶區的兩個絲氨酸突變為模擬磷酸化的谷氨酸）突變體則能促進p100的剪切。同時，IKKα-/-小鼠與p100-/-小鼠表型相似，并且在IKKα-/-細胞中，p100不能被正常剪切，而p100的剪切在IKKβ和IKKλ缺失的情況下沒有明顯異常。以上突變體和基因敲除實驗表明，IKKα可能通過被上游蛋白激酶NIK激活的方式誘導p100蛋白的磷酸化和剪切，最終生成特定的NF-κB二聚體形式——p52:RelB，這條信號轉導途徑叫做NF-κB激活的非經典途徑，因此IKKα主要參與NF-κB激活的非經典途徑。研究發現，IKKα的上述活化方式是在某些TNF家族成員的刺激下發生的，包括B細胞激活因子 （Bcell-activating factor，簡稱BAFF），淋巴毒素β（LTβ）以及CD40的配體等。但在某些情況下IKKα也會參與經典的NF-αB激活途徑。此外，IKKα還與角質細胞的分化有關，但此功能是不依賴其激酶活性的，而且與NF-κB激活無關，但有研究表示可能與其NLS有關。

IKKα-/-IKKβ-/雙敲除小鼠在NF-κB信號通路中有更多的缺陷，發育過程中無法形成神經胚，IKKα-/-IKKβ-小鼠的胚胎成纖維細胞對于TNFα、IL-1和LPS的刺激不應答，但神經胚的缺失在IKKλ-/-小鼠中沒有出現。

同IKKβ一樣，NF-κB活化的經典信號途徑也需要IKKλ。IKKλ負責將IKK復合物的催化亞基與上游信號通路聯系起來，它通過C端與上游的接頭蛋白作用激活IKK，而N端與IKKα、IKKλ結合。但在IKKα依賴的非經典信號途徑中不需要IKKλ。IKKλ的功能失活（loss-of-function）和基因敲除實驗都表明，IKKλ是NF-κB激活的經典信號途徑中IKK激酶復合物活化所必需的。IKKλ-/-小鼠在E12.5-E13天由于大量的肝細胞凋亡而死，用TNFα、IL-1和LPS等處理IKKλ-/-小鼠的胚胎成纖維細胞，IKK激酶復合物和NF-κB均不能被活化，

NF-κB的激活完全阻斷。IKKλ可能將兩個IKKα/β二聚體在空間距離上拉近，從而使它們通過transautophosphorylation作用互相活化來介導信號通路。

3 NF-κB活化的信號途徑

如前所述，NF-κB激活的信號途徑主要分為經典信號途徑（classicalpathway或canonicalpathway）和非經典信號途徑 （alternativepathway或noncanonicalpathway）(Senftlebenetal.,2001)。除此之外，研究表明還存在其它的NF-κB活化信號途徑。

3.1 NF-κB激活的經典信號途徑

在病原微生物感染或其誘導的炎癥因子的刺激下，NF-κB通常依賴經典信號途徑被活化。簡言之就是NF-κB二聚體，如p50:RelA，通過與抑制性IκB蛋白（通常是IκBα）結合而被滯留在細胞質中；某些配體與細胞表面受體（如TNF受體或Toll樣受體等）的結合招募下游接頭蛋白（如TRAF家族蛋白或RIP等），繼而招募IKK復合物 （包括IKKα、IKKβ催化亞基和IKKλ調節亞基），并導致IKK復合物的活化；IKK復合物，尤其是IKKβ亞基磷酸化IκB蛋白的兩個絲氨酸殘基，導致IκB蛋白的泛素化和蛋白酶體依賴的降解，并釋放NF-κB進入細胞核，激活下游基因轉錄。經典途徑被認為是大多數NF-κB激活的主要模式，但不是唯一模式。經典途徑激活主要誘導產生黏附分子VCAM-1、ICAM-1、E-selectin，炎癥趨化因子IL-8、RANTES、MCP-1，細胞因子IL-6、TNFα、IL-1β等，因此對于炎癥反應和固有免疫應答很重要。TNF信號通路的特征是它既可以誘導細胞的凋亡又可以促使細胞存活，這兩條通路的平衡導致細胞的活化。如果激活NF-κB的信號通路活化，結果就是使細胞存活，但如果NF-κB的活化被阻遏，TNF就變成一個有力的細胞凋亡誘導因子。TNF信號通路的兩個靶轉錄因子，NF-κB和AP-1，也直接參與凋亡或存活的選擇，長時間的JNK/AP-1的激活導致凋亡，而NF-κB可誘導合成一些效應物來阻斷JNK/AP-1信號通路，因此限制JNK/AP-1的激活，如GADD45β，通過阻斷上游的激酶MKK7抑制JNK/AP-1信號通路。但JNK和NF-κB的作用也不是完全對立的，如抗凋亡蛋白cIAP1就是JNK和NF-κB共同調節的。

研究表明，很多NF-κB信號途徑的負調節分子通過抑制TIR受體家族誘導的信號通路來發揮作用，如SIGIRR（singleimmunoglobulinIL-1Rrelatedmolecule）、ST2、IRAK-M、MyD88s（splicing variantof MyD88）等。SIGIRR是TIR受體家族的一種孤受體（orphan receptor），可能通過與受體、IRAK和TRAF6等蛋白形成復合體從而競爭性地抑制TIR信號通路；ST2也屬于TIR受體家族中的孤受體，ST2缺失小鼠的巨噬細胞在IL-1或LPS刺激時均比野生型細胞產生了更多的促炎細胞因子，有實驗證明ST2可以在LPS等刺激下誘導產生，并抑制MyD88依賴的TLR/IL-1R激活NF-κB的信號通路；IRAK-M是IRAK家族成員之一，它只在單核細胞和巨噬細胞中表達，并且在細胞受到TLR/IL-1R的配體刺激時表達量有所增加，它可能通過干擾IRAK1的功能，阻礙IRAK1與TRAF6之間的相互作用來行使負調控功能的。MyD88s是MyD88的一種剪切形式，缺失了DD和TIR結構域之間很短的一段序列。MyD88s在單核細胞中受LPS的誘導時表達量上調，但是它不能與IRAK4結合，因此它通過競爭性地阻止IRAK4被招募到受體復合物上，從而成為TIR受體家族介導的NF-κB活化信號途徑的負反饋調節因子。

NF-κB激活的非經典信號途徑。B細胞和T細胞器官發育過程中，某些胞外信號 （如LTβ、BAFF或CD40L等）的刺激會誘導NF-κB非經典信號途徑的激活。該途徑主要通過激活信號分子NIK激酶，繼而磷酸化含有兩個IKKα亞基的復合體；IKKα復合體通過磷酸化p100導致其被剪切，從而促成p52:RelB二聚體的形成，激活特定基因轉錄。p52:RelB是細胞中存在的一種NF-αB異源二聚體形式，當p52的前體分子p100與RelB結合時，二聚體處于非活性狀態，當p100被剪切產生p52時形成有活性的p52:RelB。NF-κB激活的非經典途徑是不依賴IKKβ和IKKλ的，它是由TNFR家族的部分成員，如B細胞上的BAFF-R和CD40以及脾基質細胞上的LTβR等介導的(Bonizzi et al.,2004)。非經典信號途徑的激活對于次級淋巴器官的發育和維持及適應性免疫應答很重要。

3.2 NF-κB激活的其他信號途徑

除了上述經典途徑和非經典途徑之外，NF-κB的激活也可以由IKK非依賴性的信號途徑介導。比如，紫外線（UV）輻射等刺激誘導的NF-κB的活化似乎就不需要IKK復合物的參與，而是p50（或

p52）同源二聚體與共激活因子Bcl-3等相互作用，從而具有轉錄激活活性。

4 NF-κB信號通路的調節機制

細胞內NF-κB的活性是受到嚴格的調控的，因為一旦NF-κB活化失控，就會破壞機體的平衡，導致包括各種癌癥、神經退行性疾病、毛細血管擴張失調癥、慢性炎癥及各種自身免疫疾病等多種疾病的發生。因此，研究NF-κB的活性調節機制不僅對研究細胞信號轉導的基礎理論有重要意義，而且也為相關疾病的治療及藥物研發提供了新的途徑和靶標。

許多激活NF-κB的信號通路在IKK水平上交匯，因此它是NF-κB調節機制的關鍵。IKK活化的模式可能是：在靜息狀態時，IKKα和 IKKβ與NEMO結合，掩蔽了IKK的激酶區，因此阻礙了IKK的活化。NEMO與接頭蛋白RIP等的結合或NEMO的泛素化修飾導致NEMO的寡聚化，從而使IKK復合體的構象發生改變，使IKK的激酶區暴露出來，接著激酶區內的活化環結構中兩個保守的Ser殘基通過transautophosphorylation或IKK激酶如TAK1等被磷酸化修飾，導致IKK的活化。活化的IKK接著使下游的底物磷酸化，包括IκB、IKK的NBD的Ser740和IKK的C端HLH結構域中的多個Ser位點和NEMO的Ser68等。NEMO的磷酸化使NEMO從IKK復合體上解離下來，接著分子伴侶Hsp-90/Cdc37和蛋白磷酸化酶 PP2A（protein phosphatase2A）或PP2Cβ使IKK復合體重新裝備成無活性的形式。

IKK復合物的活化是依賴于磷酸化修飾的，IKK復合物在用蛋白磷酸化酶PP2A或PP2Cβ處理時失去激酶活性，而用PP2A的抑制劑okadaic acid處理時又能恢復IKK的活性。像其它蛋白激酶一樣，IKKα和IKKβ的激酶結構域中都包含一個活化環（activation loop）結構，IKK激酶復合物受到上游信號刺激后，活化環結構中兩個保守的Ser殘基被磷酸化修飾，導致IKK的激活。IKKα主要依賴活化環結構中的Ser177和Ser181兩個位點被磷酸化而獲得激酶活性，活化的IKKβ還可以通過自身磷酸化使C端HLH結構域中的多個Ser位點進一步磷酸化。如果將IKKβ中的Ser177和Ser181都替換成丙氨酸，即將IKKβ(SS)替換成IKKβ(AA)，就會阻斷IKKβ的活化；反之，如果將它們替換成模擬磷酸化的谷氨酸，即IKKβ(EE)，則會導致IKKβ的持續活化。同樣的，IKKα蛋白的活化環結構中相應位置的Ser176和Ser180在細胞受到刺激時也有類似的修飾和功能。IKKβ的C端Ser富集區的缺失突變體在TNFα刺激下正常激活，但活化的持續時間增長，說明IKKβ的C端HLH結構域中Ser富集區的自身的磷酸化是一個負調節機制。

活化IKK復合物的激酶叫做IKK-K，很多上游的激酶被認為是IKK-K，但在基因敲除實驗中大多數都缺乏證據，這更說明IKK可能主要是通過自身的磷酸化來調節的，而更多的IKK-K可能是接頭蛋白而非激酶。IKK的自身的磷酸化可能是由于受到上游信號刺激后使得IKKα-IKKβ之間的空間距離接近或構象改變從而導致互相活化，這可以由IKK的多聚化或多種接頭蛋白如RIP、TRAF募集IKK來介導。研究表明參與NF-κB活化經典信號途徑的IKK-K可能主要是TAK1，而參與非經典信號通路的是NIK。TAK1在TNFα或IL-1等刺激下可以被激活，并且活化的TAK1存在于IKK激酶復合物中。NIK則是通過直接磷酸化并活化IKKα的方式，激活由LTβR和BAFF-R等誘導的NF-κB活化的非經典信號途徑[14]。

因為IKK的激活與很多接頭蛋白有關，如RIP、TRAF等，所以也可以通過這些接頭蛋白間接的調節IKK的激活。如前所述，泛素化的修飾在此類調節中發揮了很重要的作用，研究表明，通過泛素分子第48位賴氨酸（K48）連接的多聚泛素鏈的修飾通常與蛋白降解有關，而K63位連接的泛素化修飾通常與蛋白功能的調節有關。TRAF家族蛋白可以作為E3泛素連接酶將自身和IKKλ以K63位連接的方式泛素化，并通過共價連接的多聚泛素鏈與TAB2-TAB3-TAK1復合體相互作用，從而使TAK1活化激活 IKK復合物。而去泛素化酶DUB通過去除RIP、TRAF以及IKKλ等蛋白的K63位泛素化而起到負調節的作用，如A20和CYLD。A20依賴其N端去泛素化酶結構域OTU去除RIP蛋白的K63位連接的多聚泛素鏈，從而抑制RIP的功能；再借助其C端鋅指結構域的泛素連接酶功能使RIP被K48位連接的泛素化修飾，從而使RIP被蛋白酶體降解。因此A20是通過去除RIP蛋白的K63位功能調節型泛素化和誘導K48位降解型泛素化修飾的

雙重作用來進行負調控的。CYLD依賴其C端的一個在Dubs家族中廣泛存在的UBP結構域發揮去泛素化作用，它通過與TRAF2和IKKα分別相互作用，特異地去除它們的K63位連接的泛素鏈，從而阻斷IKK復合物的活化。

另外，還有一些蛋白通過與IKK結合來調節IKK的激活，如Hsp-90/Cdc37和ELKS。Hsp90可能在IKK激酶復合物中充當分子伴侶的作用，促進激酶蛋白的正確折疊，Hsp-90/Cdc37的抑制者GA，抑制了TNFα刺激下的IKK的激活，它也可以和NF-κB信號通路中的多種激酶作用，如RIP、NIK、TBK1等，有研究表明，Hsp-90/Cdc37可能和IKKα結合從而調節IKKα的寡聚狀態。ELKS是通過免疫親和純化的方法篩選出來的與IKKα相互作用的蛋白，它的結構與IKKα相似也含有CC結構域和LZ結構域。在未受刺激的細胞中，ELKS是IKK復合物的化學組分之一。RNAi介導的ELKS表達量的降低抑制了IKK的激活以及TNFα和IL-1誘導的前期NF-κB的激活，但是對NF-κB后期激活沒有顯著影響。另外，在免疫共沉淀實驗中ELKS與IκBα能夠相互結合，而降低ELKS的表達量則破壞了IKK復合物與IκBα的結合，表明ELKS可能招募IκBα到IκBα復合物中IKK。

NF-κB的活化還可以通過IκB蛋白來調節，主要涉及IκBα。我們都知道IκB蛋白的降解釋放了NF-κB二聚體，使其可以入核激活相應基因的轉錄。IκBα也是NF-κB轉錄激活的靶基因之一，NF-κB的活化導致IκBα的表達，產生的IκBα蛋白進入細胞核內與活化的NF-κB結合，由于NF-κB與IκBα的親和力大于其與DNA結合的親和力，于是NF-κB和IκBα復合體從DNA上解離下來，并通過IκBα分子上的核輸出信號 （nuclearexportsignal，簡稱NES）將NF-κB帶回細胞質中，從而中止NF-κB的活化。因此，NF-κB的活化一方面啟動很多效應基因的轉錄，另一方面生成IκBα蛋白負反饋調節NF-κB的活性，中止NF-κB活化信號，從而控制NF-κB的應答的強度和持續時間[16]。除了誘導產生IκBα對NF-κB的轉錄激活進行調節外，還有很多方式影響NF-IκB的轉錄激活活性，如NF-κB家族蛋白的翻譯后的修飾、與一些轉錄共因子作用等。NF-κB家族蛋白的翻譯后的修飾涉及磷酸化修飾及乙酰化修飾，以p65為例，蛋白激酶A（PKA）可以使p65的Ser276磷酸化，此磷酸化有兩個作用，一是可以增強p65與DNA的結合能力；一是為轉錄共激活因子CBP/p300提供一個作用位點，未磷酸化的p65，C端與Rel區相互作用，因此阻礙了p65與DNA及CBP/p300的結合，Ser276位的磷酸化阻止了這種分子內的C端與N端的作用，因此增強了NF-κB的轉錄激活活性；此外IKK也可以通過對p65的Ser536位磷酸化來增強NF-κB的轉錄激活活性。研究表明p65共有4個磷酸化位點，2個在Rel同源區（Ser276、Ser311），2個在TAD區，轉錄的激活可能需要每組中至少一個位點磷酸化。而p65的乙酰化涉及多個位點，其中K218、K221的乙酰化增強轉錄激活活性，可能是通過減弱與核內IκBα的結合的方式來作用，而K122、K123的乙酰化則抑制轉錄激活活性，可能是降低了與DNA的親和力。NF-κB還可以與一些轉錄共因子作用，如C/EBP，AP-1，Sp-1，SRF，STAT6等，來調節其轉錄激活[17]。

5 小結與展望

總之，NF-κB信號通路對于機體的固有免疫和炎癥反應以及適應性免疫等生理病理過程是非常關鍵的，因此NF-κB信號通路的失控會導致許多人類疾病，尤其是與慢性炎癥、免疫缺陷以及癌癥相關的疾病，如哮喘、動脈粥樣硬化、炎性腸炎，AIDS、類風濕性關節炎、癌癥等。研究表明，許多類型的癌癥中都存在NF-κB的組成型激活。因此，對轉錄因子NF-κB活化機制的研究，不僅對于探討細胞信號轉導的基礎理論有重要的意義，而且也為某些疾病的治療及藥物開發奠定了理論基礎，提供了新的途徑和靶標。近年來的研究已極大的完善和補充了NF-κB信號通路，但仍有許多問題等待解決，如對于不同的NF-κB二聚體的調節、泛素化修飾的確切的調節功能、以及細胞應激引起的NF-κB的活化的具體機制等等，都需要更深入的研究。

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TN911.6

甘肅省自然科學基金項目（NO.1107RJZA141）；蘭州市社會發展項目（NO.2013-3-72）

△ 通訊作者：朱嘉寧，碩士。研究方向：動物保護生物學，Email:bluedreame@163.com。