高分辨質譜數據MDF技術的進展*

侯艷婷，王曉明，張家偉，2，潘桂湘

（1.天津中醫藥大學，天津市現代中藥重點實驗室（培育），天津 300193；2.天津國際生物醫藥聯合研究院，天津 300457）

·綜 述·

高分辨質譜數據MDF技術的進展*

侯艷婷1,2，王曉明1，張家偉1，2，潘桂湘1

（1.天津中醫藥大學，天津市現代中藥重點實驗室（培育），天津 300193；2.天津國際生物醫藥聯合研究院，天津 300457）

近年來，質譜在藥物鑒定中的應用日益廣泛，許多質譜采集及數據挖掘技術，如全信息串聯質譜（MSE）掃描、提取離子流技術、中性丟失過濾技術、產物離子過濾技術等，也相應得到較大程度的開發和發展。其中一種基于高分辨質譜數據的過濾技術——質量虧損過濾技術(MDF)，根據代謝物與原形藥物具有相近的質量虧損這一規律，對采集的高分辨質譜數據進行處理和識別，通過一次或有限幾次進樣可從復雜背景中發現和鑒定藥物及其代謝產物，顯現出獨特的優勢。

質量虧損過濾；代謝物鑒定；中藥成分鑒定

三重四極桿（QQQ）、線性離子阱（LTQ），四極桿－線性離子阱（Q－trap）、四極桿－飛行時間（Q－TOF）等液質聯用儀，在代謝物鑒定中有較多的應用[1-3]。對于可預測或已知生物轉化反應的代謝產物，可采用中性丟失、前體離子和多反應監測（MRM）等掃描方式，或利用提取離子流（EIC）方法等，靶向分析代謝產物；但對于非常規或多步生物轉化反應形成的代謝產物，尤其當存在大量內源性化合物干擾時，上述鑒定策略存在較大的局限[4-5]。

質量虧損是指某一元素（或化合物）的精確質量數與它最接近的整數值之間的差異[6]。2003年Zhang等[7]發現代謝物與原型藥物小數部分的精確質量數變化范圍不大，質量虧損通常在幾十個毫道爾頓之內，例如羥基化的質量虧損是-5 mu，脫氫是-16 mu，脫甲基化是-23 mu，葡萄糖醛酸結合是+ 32mu，硫酸化是-43mu，谷胱甘肽結合（GSH）是68mu，代謝產物質量虧損均在可預測范圍內[8]，據此提出了基于高分辨質譜數據的質量虧損過濾技術（MDF）。與代謝物類似，中藥具有母核結構相同而取代基稍有不同的類似物，它們經羥基化、甲基化、甲氧基化、糖基取代或結合反應而成，與母體化合物的質量虧損差異不大。因此，在代謝物和中藥結構類似物鑒定過程中，可以通過設定質量虧損范圍，利用MDF技術對采集的高分辨質譜數據進行處理和識別，從復雜背景中篩選已知或未知的代謝產物/中藥結構類似物，發揮其獨特的技術優勢。

1 常規MDF技術

常規MDF技術，根據母體藥物與核心亞結構的質量虧損，估計代謝產物的質量虧損落在什么區間，預先設定過濾標準，在全掃描質譜數據集中提取代謝產物離子，排除所有落在期望范圍之外的離子，從而在復雜生物基質中快速挖掘出可能的代謝產物[9]。它無需考慮代謝產物不同的裂解類型，而主要考慮代謝產物與過濾模板之間質量虧損的相似性。

MDF的篩選模板主要分為4類[10]：1）適用于質量、結構與母體相似的代謝物，例如發生氧化、還原、脫烷基（＜50 mu）等反應，使母體化合物加上或減去一個或幾個C/H/O/N等。2）適用于母體裂分產生的小分子化合物，如水解反應。3）適用于母體化合物加合產生的大分子化合物，如結合型代謝物；4）適用于脫鹵代謝物，即母體化合物脫去一個或多個鹵素。其中模板1）、2）、4）涉及母體產生的氧化、還原、水解反應，3）主要為母體的結合反應。

MDF技術早期應用于體內血液、尿液、膽汁、糞便[11-14]中代謝物的檢測。為了印證MDF技術在代謝物檢測方面的有效應性，有學者開展了代謝輪廓譜分析，結果顯示MDF技術確實能夠在復雜基質中篩選出目標化合物，但其在尿液中的檢測結果較血液、膽汁、糞便稍差[12]。隨著時間的推移，該技術拓展應用到組織樣品如肝微粒體、腸菌和中藥結構類似物的鑒定[15-19]。Morales-Gutierrez[20]利用MDF技術，檢測沙氟沙星、恩諾沙星、環丙沙星、雙福沙星在pH改變、反復凍融等處理條件下的物質轉化，及其在雞肉肌肉組織中代謝物。最終鑒定了恩諾沙星21個轉化物，環丙沙星6個轉化物，雙福沙星14個轉化物，沙氟沙星12個轉化物，以及它們在肌肉組織的14個代謝產物。王廣基等[21]利用MDF技術，選取麥冬皂苷和麥冬高異黃酮為模板，對麥冬提取物進行數據挖掘，鑒定了50個麥冬皂苷類和27個麥冬高異黃酮類化合物。

但常規MDF技術由于只選擇單一的母體化合物為模板，其質量虧損范圍設置較寬，常導致篩選結果偏差大，干擾性化合物多。隨著數據挖掘技術的發展，學者們在常規MDF技術基礎上開發了一些新型的MDF技術。

2 多重MDF技術（MMDF）

MMDF技術，選取多個化合物為模板，分別對各類型的化合物進行篩選。相較于常規MDF，它可以在有限的進樣次數中，篩選出更多的代謝物或同系物。屠鵬飛等[22]利用MMDF技術，選取去氧五味子素的原型及其4個代謝物為模板，對大鼠尿液和糞便中的代謝物進行檢測，共鑒定了51個代謝產物，其中49個為I相代謝產物，2個為II相代謝產物。Qian Ruan等[23]采用MMDF技術，選取噻氯匹定-谷胱甘肽加合物、脫氯噻氯匹定-谷胱甘肽加合物、氯苯甲醛-谷胱甘肽加合物、四氫化噻吩并吡啶-谷胱甘肽加合物為模板，對噻氯匹定經大鼠肝微粒體孵育后與谷胱甘肽結合的產物進行檢測，共篩選出17個與谷胱甘肽結合的代謝產物，確定了噻氯匹定體外的代謝途徑。

3 逐級MDF技術（stepwise MDF）

逐級MDF技術，通過確定不同取代基化合物的母體結構，以及取代基的數量，選取多個質量虧損過濾窗口或多個質量范圍，可以篩選出更多的化合物。張加余[24]總結了黃酮類化合物結構規律，確定黃酮分子量范圍為282～436 Da，取代基最高為5個甲基，最低為5個羥基，從而設置質量虧損范圍為70 mu至166 mu，利用逐級MDF技術，分五段對柑橘中的多甲氧基黃酮進行篩選，共鑒定出81個成分，較常規MDF技術(鑒定30多個成分)檢出了更多的化合物。德國學者Macherius[25]，利用逐級MDF技術對辣根醬中三氯生代謝物進行檢測，成功篩選出了33個化合物。

4 線性梯度MDF技術（linear gradient MDF）

線性梯度MDF技術，以多個化合物為模板，用曲線連接各模板化合物的質量數，形成一個動態質量過濾曲線，將曲線兩端平行延長50 Da，質量虧損值設為一定的區間范圍，則認為分子量落在這一區域內的化合物可能是代謝物或結構類似物（見圖1）。該技術利用Waters公司UPLC/Q-TOF-MS的MSE掃描模式進行數據采集，然后采用Metabolynx XS軟件中的MDF工具對數據進行處理。王喜軍等[26]利用線性梯度MDF技術，對茵陳四逆湯中的烏頭類生物堿進行檢測，以Songorine、Senbusine A、Hypaconitine 3個化合物為模板，將質量虧損范圍設定在-38mu到23 mu之間，共篩選識別145個化合物，通過假陽性篩選剔除55個化合物，通過元素分析和質譜裂解規律剔除27個化合物，最終鑒定了62個烏頭類生物堿；而采用傳統的氣質或液質方法，只能鑒定出15個烏頭類生物堿。

圖1 線性梯度MDF概圖Fig.1 Schematic of linear gradient MDF

5 五點篩查MDF技術（five-pointscreeningMDF）

五點篩查MDF技術，將MDF與數學中的邊界理論[27]相結合，以5個化合物（a、b、c、d、e）為模板，連接五個點，確定篩選范圍（見圖2），它使篩選結果不再是一個開放的空間，理論上能夠將其他干擾類型的化合物排除在外。五點的選擇原則如下：a點為分子量最低的化合物；b、c點為小的取代基連接小的糖配基的化合物，b、c兩點相連確定質量虧損的下界限；d、e點為大的取代基連接大的糖配基的化合物，d、e兩點相連確定質量虧損的上界限；上下界限斜率與取代基的數量和種類相關。李萍等[28]采用五點篩查MDF技術，選取最小質量數的B7型人參皂苷為a點，3個氧（負貢獻最?。┤〈凝R墩果酸型皂苷為b點，5個木糖（正貢獻第二大）3個二甲?；ㄕ暙I最?。┤〈凝R墩果酸型皂苷為c點，7個鼠李糖取代（正貢獻最大）的去氫A1型人參皂苷為d點，1個鼠李糖取代的去氫A1型人參皂苷為e點，五點順次連接確定皂苷類化合物的篩選范圍及邊界斜率，結合診斷離子分析和視覺同位素技術，共鑒定了三七中234個皂苷類成分，其中67個為潛在的新化合物。

圖2 五點篩查MDF概圖Fig.2 Schematic of five-point screening MDF

6 MDF技術與其他數據挖掘技術的整合

將MDF技術與提取離子流（EIC）、子離子過濾（PIF）、中性丟失過濾（NLF）、同位素過濾（IPF）、診斷碎片離子（DFI）等數據挖掘技術整合，串聯或并聯使用，可增加復雜生物基質樣品中微量代謝物檢測的靈敏度和選擇性。姚新生等[29]將MDF技術與EIC相結合，鑒定大鼠口服參松養心后的入血成分，成功檢測出92個外源性成分，其中45個為原型藥物，47個為代謝產物。RuanQ[8]將MDF技術和EIC/ NLF/PIF相結合，對大鼠肝S9孵育液中茚地那韋的代謝物進行鑒定，共檢測出15個代謝產物，其中2個為新發現的代謝產物。Tian[30]將MDF技術和DFI相結合，對馬錢子中二氫吲哚類生物堿進行鑒定，先采用MDF技術減少背景噪音，然后利用DFI確定化合物的結構，對于無法確證的同分異構體5和11，輔以量子化學計算法，確定其分別為2-羥基-3-甲氧基士的寧和4-羥基-3-甲氧基士的寧。

7 展望

MDF技術可以通過設定質量虧損范圍，從復雜背景中篩選出代謝物或中藥結構類似物，操作簡便。隨著多種優化技術[31]的出現，以及與其他數據挖掘技術的結合，相信MDF的鑒定結果可靠性將不斷提高，得到更加廣泛的應用。

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Advance of mass defect filter technique by high-resolution mass spectrometry

HOU Yan-ting1,2,WANG Xiao-ming1,ZHANG Jia-wei1,2,PAN Gui-xiang1
（1.Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193, China;2.Tianjin International Joint Academy of Biotechnology and Medicine,Tianjin 300457,China）

In recent years,with the development of the high resolution mass spectrometry,its application in medical field has expanded, followed by the development and exploitation of the related data mining techniques of mass spectrometry,such as extract ion chromatography technology,neutral lost filtering technology,and product ion filtering technology.In all of those methods,a novel date filtering technology,the mass defect filter(MDF)which is produced by processing and identifying the collected dates according to the similarity mass defect between prototype drugs and its metabolites can select and identify drug and its metabolites from complex matrix via once or limited injection.And it had shown greatest advantage in this field.

mass defect filter;metabolites identification;traditional Chinese medicine ingredient identification

R284.1

A

1672-1519（2016）12-0765-04

2016-05-01）

（本文編輯：高 杉，馬 英）

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.12.16

國家自然科學基金項目（81173523、81303182）；國家重大新藥創制項目（2012ZX09101202）；國家973計劃項目（2012CB723504）。

侯艷婷（1991－），女，碩士研究生，主要從事藥物分析工作。

潘桂湘，E-mail:guixiangp@163.com。