姜黃素通過Wnt/β-catenin信號通路抑制晶狀體上皮細胞增殖的實驗研究*

包秀麗，劉婷婷，張海濤，張利民

（內蒙古醫科大學附屬醫院眼科，呼和浩特 010050）

姜黃素通過Wnt/β-catenin信號通路抑制晶狀體上皮細胞增殖的實驗研究*

包秀麗，劉婷婷，張海濤，張利民

（內蒙古醫科大學附屬醫院眼科，呼和浩特 010050）

[目的]探討姜黃素通過Wnt/β-catenin信號通路對人晶狀體上皮細胞（LECs）增殖的影響及其可能的作用機制，為晶狀體后囊膜混濁（PCO）的臨床治療提供新的靶點。[方法]人LECs系SRA 01/04細胞為研究對象，實驗分為3組:Wnt3a組，姜黃素組和對照組。Wnt3a組采用脂質體介導轉染技術將Wnt3a cDNA表達載體瞬時轉染入人SRA 01/04細胞中，構建PCO的細胞模型。姜黃素組在轉染Wnt3a cDNA表達載體48 h后加入20 μmol/L姜黃素，對照組轉染pcDNA3-HA表達載體。采用Western blot技術驗證載體在轉染細胞中的表達，CKK-8實驗檢測姜黃素對SRA 01/04細胞增殖能力的影響，采用免疫細胞化學法檢測Wnt3a過表達后增生細胞核抗原（PCNA）蛋白表達的變化；Western blot法檢測Wnt3a過表達對Wnt/β-catenin下游信號分子cyclin D1和c-Myc蛋白表達的影響；應用免疫熒光法檢測Wnt3a過表達后β-catenin表達的定位變化。[結果]Western blot檢測證實，轉染pcDNA3-HA表達載體后,SRA 01/04細胞內Wnt3a蛋白表達明顯升高。CKK-8檢測表明，姜黃素組SRA 01/04細胞的增殖率明顯低于Wnt3a組（t=2.782，P=0.049）。姜黃組SRA 01/04細胞PCNA蛋白表達陽性率為 23.6%±4.0%，明顯低于Wnt3a組的43.4%±5.4%，差異有統計學意義（t=2.951，P=0.018）。轉染后48 h，β-catenin蛋白密集分布于Wnt3a組細胞核和細胞質中，而在對照組僅出現于細胞之中，姜黃素組β-catenin蛋白主要分布于細胞核中，少量分布于細胞質中。Western blot檢測姜黃素組Wnt/β-catenin信號通路靶蛋白Cyclin D1和c-Myc蛋白表達明顯低于Wnt3a組。[結論]在SRA 01/04細胞中，姜黃素抑制Wnt3a過表達誘導的Wnt/β-catenin信號通路活化，下游靶蛋白Cyclin D1和c-Myc表達下調，抑制人LECs的增生。

姜黃素；Wnt3a；晶狀體上皮細胞；Wnt/β-catenin信號通路；細胞增殖；后囊膜混濁

后囊膜混濁（PCO）是白內障囊外摘除術后最常見的并發癥，大約有20%～40%的患者術后2～5 a會發生PCO。目前的研究認為PCO的發生主要是由于手術后殘余的晶狀體上皮細胞（LECs）增殖、遷移、發生上皮間充質轉化，與沉積的膠原一起形成了晶狀體囊袋內的纖維斑塊[1]。姜黃素是姜黃的主要活性成分，近年來有研究發現姜黃素具有抑制腫瘤細胞生長、轉移和抗炎作用。本實驗在體外研究探討了姜黃素對晶狀體上皮細胞系HLE B-3細胞增殖的影響及其作用的信號通路，為今后PCO的防治提供部分實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 SRA 01/04細胞株（中國醫學科學院腫瘤細胞庫）；姜黃素（美國Sigma公司）；右旋-纈氨酸基礎培養液（DMEM）培養基、胎牛血清購自（美國 Gibco公司）；CCK-8試劑盒購自日本DOJINDO公司；甲基四唑藍（MTT，美國 Sigma公司）;脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）;小鼠抗人單克隆PCNA抗體、羊抗小鼠二抗（北京中杉公司）；BCA蛋白定量試劑盒（Pierce公司）；小鼠抗人β-catenin單克隆抗體、兔抗人cyclin D1單克隆抗體、兔抗人c-myc單克隆抗體、羊抗兔/小鼠二抗、小鼠抗人β-actin（Santa cruz公司）化學發光ECL法（Millipore公司）；羊抗小鼠IgG Alexa Flour488（Invitrogen公司）。

1.2 儀器及試劑 VD-650-U型超凈工作臺（上海楚度儀器設備有限公司）；MCO-175型CO2培養箱（日本三洋集團）；UV-1800 PC型紫外-可見分光光度計（廣州科曉科學儀器有限公司）；BS-300型全自動生化分析儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）；Model-680型酶標儀（美國BIO-RAD公司）；FACS Aria型流式細胞儀（美國BD公司）；DYY-11型多用電泳儀、JY-SCZ2電泳槽（北京六一儀器廠）;倒置顯微鏡（日本Olympus IMT-413）；共聚焦顯微鏡（德國Leica）。

1.3 細胞轉染及實驗分組 將SRA 01/04細胞株放人含10%胎牛血清、DMEM培養液中，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養。實驗分為3組：Wnt3a組，姜黃素組，對照組。轉染前l d，將對數生長期的細胞以每孔4×105的濃度接種于6孔板內，加入不含抗生素的DMEM（含15%胎牛血清）2 mL進行培養。Wnt3a組將4 μg構建的Wnt3a cDNA表達載體[1]和10 μL脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000分別用250 μL DMEM稀釋，輕柔混勻，室溫下孵育5 min，再將兩者混合孵育20 min，加入6孔板的培養液中。姜黃素組在細胞轉染Wnt3a cDNA表達載體后48 h加入20 μmol/L姜黃素,為保證培養液中姜黃素的濃度，每24 h加入10 μmol/L姜黃素，加入姜黃素48 h后收集細胞做進一步分析測定，將pcDNA3-HA質粒轉染作為對照組。

1.4 CCK-8細胞增殖實驗 細胞增殖能力用細胞增殖-毒性檢測試劑盒（CCK8，購自東仁化學有限公司）檢測。將Wnt3a組，姜黃素組和對照組細胞胰酶消化后接種至5個96孔板中，接種密度為2 000個/孔，每種細胞每板種18個復孔,分別培養不同時間（1、2、3、4、5 d）后，每孔加5 g/L的CCK8溶液10 μL，37℃孵育3 h后,酶標儀檢測450 nm處的OD值，每組實驗重復3次。

1.5 細胞免疫化學 將pcDNA3-HA/SRA 01/04及Wnt3a/SRA 01/04細胞以5×104/mL提前鋪于含有蓋玻片的12孔盤中，4%多聚甲醛（PFA）固定10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，加入小鼠抗人單克隆PCNA抗體4℃孵育過夜，PBS沖洗，用羊抗小鼠二抗室溫孵育30 min，二氨基聯苯胺法（DAB）顯色，蘇木素復染，脫水，封片。于400×光學顯微鏡視野下計數陽性細胞數比例，每片計數10個視野，以陽性細胞百分數代表蛋白表達陽性率。

1.6 Western blotting 在細胞中加入1×SDS細胞裂解液，獲取細胞蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質濃度后，取35 μg樣品進行SDS-PAGE，電泳完畢后，應用電轉儀將樣品轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入一抗：小鼠抗人Wnt3a單克隆抗體（1∶1 000）、兔抗人cyclin D1單克隆抗體（1∶1 000）和兔抗人c-myc單克隆抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜，洗膜后加入相應羊抗兔/小鼠二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，洗膜后化學發光ECL法顯影，暗室曝光。以小鼠抗人β-actin（1∶5 000）作為內參陽性對照。

1.7 免疫熒光 將 pcDNA3-HA/SRA 01/04及Wnt3a/SRA 01/04細胞以5×104/mL提前鋪于含有蓋玻片的12孔盤中，4%多聚甲醛（PFA）固定10 min，PBS沖洗，50 mmol/L氯化銨焠滅游離PFA10 min；PBS沖洗，0.5%sponin室溫處理10 min；PBS沖洗，3%BSA封閉室溫1 h；PBS沖洗，加入小鼠抗人βcatenin單克隆抗體（1∶50）4℃孵育過夜，PBS洗3次，加入羊抗小鼠IgG Alexa Flour488（1∶200）避光室溫1 h；PBS洗3次，加入4，6-二乙酰基-2-苯基吲哚酸鹽（DAPI）染核，避光室溫10 min；PBS洗2次，將蓋玻片移至載玻片上，用抗熒光衰減封片劑mowoil封片，共聚焦顯微鏡觀察、拍照。

1.8 統計學處理 結果應用SPSS 16.0統計學軟件處理系統進行定理。本研究測量指標的數據資料用均數±標準差（s）表示，組間的差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，采用雙尾檢測法，以P＜0.05為具有統計學意義。

2 結果

2.1 利用脂質體轉染技術使SRA 01/04細胞中Wnt3a過表達 收集經脂質體轉染48 h后的SRA 01/04細胞蛋白，Western blot檢測證實，與轉染pcDNA3-HA的SRA 01/04細胞相比，轉染Wnt3a cDNA表達載體的SRA 01/04細胞內Wnt3a蛋白表達明顯升高，提示在SRA 01/04細胞中外源性Wnt3a基因得到了表達。見圖1。

2.2 姜黃素抑制SRA 01/04細胞增殖 CCK-8實驗檢測結果顯示，Wnt3a組OD值明顯高于對照組及姜黃素組（F=7.219，P=0.016），證明SRA 01/04細胞轉染Wnt3a cDNA表達載體后細胞增殖能力明顯增強，組間兩兩比較姜黃素組OD值明顯低于Wnt3a組（t=2.782，P=0.049），表明姜黃素抑制SRA 01/04細胞增殖。見圖2。

2.3 姜黃素抑制SRA 01/04細胞核內PCNA的表達 免疫細胞化學檢測結果顯示PCNA表達于SRA 01/04細胞的細胞核內，呈棕黃色，PCNA在姜黃素組和對照組的SRA 01/04細胞中表達陽性率較Wnt3a組低（23.6%±4.0%,6.0%±1.6%vs 43.4%± 5.4%，F=22.15，P=0.000 1），而在Wnt3a組中SRA 01/04細胞中表達陽性率較姜黃素組明顯增加（43.4%±5.4%vs 23.6%±4.0%，t=2.951，P=0.018）。提示姜黃素能夠抑制SRA 01/04細胞增殖。見圖3。

圖1 pcDNA3-HA/SRA 01/04及Wnt3a/SRA 01/04細胞中Wnt3a蛋白的表達Fig.1 Expression of Wnt3a protein in pcDNA3-HA/SRA 01/04 and Wnt3a/SRA 01/04 cells

圖1pcDNA3-HA/SRA 01/04及Wnt3a/SRA 01/04細胞中Wnt3a蛋白的表達

Fig.1 Expression of Wnt3a protein in pcDNA3-HA/SRA 01/04 and Wnt3a/SRA 01/04 cells

圖2 CCK8實驗檢測各組細胞在第1,2,3,4,5天的細胞增殖能力Fig.2 CCK8 assay was conducted to detect the proliferation ability of cells in 1,2,3,4,and 5 d,respectively

圖2 CCK8實驗檢測各組細胞在第1,2,3,4,5天的細胞增殖能力

Fig.2 CCK8 assay was conducted to detect the proliferation ability of cells in 1,2,3,4,and 5 d,respectively

圖3 PCNA在各組細胞中的表達Fig.3 Expression of PCNA in each group

2.4 姜黃素抑制β-catenin由胞漿轉入胞核 免疫熒光檢測卻發現β-catenin蛋白在Wnt3a組中SRA 01/04細胞胞漿和細胞核內大量積聚，而在對照細胞中卻只分布在胞漿中，提示Wnt3a過表達引起細胞內的核轉錄激動因子β-catenin積聚并轉入細胞核中，Wnt/β-catenin信號通路活化。而姜黃素組中β-catenin蛋白大部分分布于胞漿中，細胞核內只有少量β-catenin蛋白，說明姜黃素能夠抑制Wnt/βcatenin信號通路的核轉移。見圖4。

圖4 β-catenin在各組細胞中的表達Fig.4 Expression of β-catenin in each group

2.5 姜黃素下調Wnt/β-catenin信號通路靶蛋白Cyclin D1和c-Myc表達 Western blotting檢測結果顯示，Wnt3a組的SRA 01/04細胞中Cyclin D1和c-Myc蛋白表達較對照組明顯增加，而姜黃素組細胞中Cyclin D1和c-Myc蛋白表達明顯減弱，表明Wnt/β-catenin信號通路活化后，可引起Cyclin D1和c-Myc的表達增加，而姜黃素能夠抑制Wnt/βcatenin信號通路的核內靶基因Cyclin D1和c-Myc的表達。見圖5。

3 討論

姜黃素是姜黃中提取的一種植物多酚，也是姜黃藥理作用的主要活性成分。中醫認為姜黃能行氣、散風活血、通經止痛，近年的研究證明姜黃具有防癌抗癌、抗纖維化、抗炎、抗氧化、清除自由基以及促進凋亡等作用[2-3]。已有研究發現，姜黃素能有效抑制EGF誘導的LEC增殖[4]，而姜黃素-羥甲基-β-環糊精能夠抑制兔眼PCO的發生，但其發生機制尚不清楚[5]。研究發現，姜黃素能夠通過調節P53、PTEN、Caspase-3、Hedgehog及NF-κB等信號通路活性，發揮腫瘤抑制作用細胞及誘導凋亡[6-7]，還可能通過下調Wnt/β-catenin通路抑制膠質瘤細胞增殖[8]。

圖5 c-Myc和CyclingD1在各組細胞中的表達Fig.5 Expression of c-Myc and CyclingD1 in each group

筆者前期的實驗發現Wnt/β-catenin信號通路與晶狀體上皮細胞的增殖密切相關，β-catenin是經典Wnt信號通路中關鍵的信號蛋白，Wnt3a誘導經典Wnt信號通路活化，促進β-catenin在細胞質中積聚并轉移入細胞核中，激活核內靶基因的轉錄[1]。其中，cyclin D1和c-Myc基因是Wnt/β-catenin信號通路重要的核內靶基因，也是細胞增殖的重要調控因子，其上調能夠促進細胞由G1期向S期轉換，促進處于休眠狀態的細胞進入分裂期，從而影響細胞周期，從而促進晶狀體上皮細胞增殖[9]。姜黃素還可以通過下調的β-catenin和c-Myc的表達抑制膠質瘤細胞的增殖[8]。通過Western blot和免疫熒光技術檢測β-catenin蛋白的表達，觀察到在轉染Wnt3a cDNA后的SRA01/04細胞內存在β-catenin的核內積聚，證明轉染后產生Wnt3a目的蛋白，并分泌到細胞外，與相關的膜受體結合并使細胞內的βcatenin轉入細胞核內，活化Wnt/β-catenin信號通路，而姜黃素能夠抑制Wnt3a誘導的β-catenin核轉染，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化。

CCK-8實驗結果顯示姜黃素抑制SRA 01/04細胞的增殖。Kim TD等[10]發現姜黃素可以通過減弱Wnt信號通路及細胞間黏附，使HCT-116細胞停滯于G2/M期并使其凋亡。應用cDNA芯片的方法分析調節細胞周期相關的基因表達，結果發現姜黃素誘導細胞阻滯于G0/G1和/或G2/M期，從而抑制細胞增殖[11-12]。免疫細胞化學檢測還發現，Wnt/βcatenin信號通路活化后SRA 01/04細胞核內PCNA蛋白呈現高表達，PCNA是真核細胞DNA合成時所必需的一種細胞周期調節酸性核蛋白，其在細胞核中陽性表達的程度與細胞增殖活性密切相關[13]。

本研究發現姜黃素通過抑制Wnt/β-catenin信號通路下調SRA 01/04細胞中cyclin D1和c-Myc蛋白表達。一些研究已表明姜黃素能夠通過下調cyclin D1和c-Myc的表達，降低分裂期細胞的比例，從而抑制細胞增殖[12，14]。在對姜黃素抑制腫瘤和心血管保護作用機制研究中發現姜黃素能夠調節某些基因表達和相關的信號傳導通路，基因芯片技術檢測發現c-Myc是姜黃素治療的重要靶基因。Myc是轉錄因子螺旋-環-亮氨酸拉鏈家族的成員之一，能夠形成MYC-MAX復合物，Myc是一種腫瘤基因蛋白產物，參與腫瘤細胞增殖、分化和凋亡[15]。10 nmol的姜黃素可以將Myc mRNA的表達下調60%，還有實驗發現姜黃素治療后僅有21.95%的細胞表達Myc基因[15-16]，而體內實驗也證明姜黃素通過下調c-Myc基因表達抑制細胞增殖[17]。姜黃素可以下調cyclin D1和p21抑制從而非小細胞性肺癌的腫瘤干細胞的增殖，還可以降低髓母細胞瘤細胞的β-catenin和其靶基因cyclin D1的表達，使細胞周期停滯于G2/M期，抑制腫瘤的增殖[18]。這一結果與其他體外實驗結果相似[19]。

本研究結果表明 Wnt3a通過抑制 Wnt/βcatenin信號通路下調cyclin D1和c-Myc的表達，進而發揮抑制人晶狀體上皮細胞增殖作用。由于PCO的發生發展是一個多階段逐步演變的過程，手術后殘余的晶狀體上皮細胞的異常增殖是PCO早期階段重要的病理變化之一，提示姜黃素可作為PCO基因治療或預防的新靶點。

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Curcumin regulation of human lens epithelail cell proliferation through Wnt/β-catenin signaling pathway

BAO Xiu-li,LIU Ting-ting,ZHANG Hai-tao,ZHANG Li-min
（Department of Ophthalmology,The Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010050,China）

[Objective]To investigate the effects of curcumin on proliferation of human lens epithelial cells(LECs)and its mechanism and to provide a new gene target in the prevention and treatment of PCO.[Methods]The research objects were the human LECs SRA 01/ 04.The experiment was divided into three groups:Wnt3a group,curcumin group and control group.In Wnt3a group,human Wnt3a cDNA expressing vector targeted human LECs was constructed to PCO model.In curcumin group,curcumin of 20 μmol/L was added after 48 hs of transfection.pcDNA3-HA expression vector was used as the control group.The expression of Wnt3a was identified by Western blot assay after transfected.The growth and proliferation of SRA 01/04 cells were detected by CCK-8 test.The expression and localization of proliferating cell nuclear antigen (PCNA)were analyzed by immunocytochemistry for the exploration of the mechanism of curcumin to proliferation of LECs.The expressions of cyclin D1and c-Myc in the cells were detected by Western blot assay.β-Catenin expression was localized using immunofluorescence assay.[Results]The expression of Wnt3a was verified in the Wnt3a transfected group compared with the control group.CCK-8 test indicated that the cell proliferating rate was significantly difference between the curcumin group and Wnt3a group（t=2.782，P=0.049）.The positive expression rate of PCNA protein in SRA 01/04 was 23.6%±4.0%in the curcumin group and 43.4%±5.4%in the Wnt3a group with a significant difference between them (t=2.951,P=0.018).After 48 hours of treatment with curcumin,the immunofluorescence was stronger in cell nucleus,and the expressions of cyclin D1 and c-Myc proteins were elevated in SRA 01/04 cells in wnt3a group,but he immunofluorescence was stronger in cytoplasm,and the expressions of cyclin D1 and c-Myc proteins were less in SRA 01/04 cells in curcumin group and controls.[Conclusion]Curcumin depressed the Wnt/β-catenin signaling pathway and downregulates the expression of a subset of target genes,including cyclin D1 and c-Myc,which plays an important role in inhibiting the proliferation of human LECs.

curcumin;Wnt3a;lens epithelial cell;Wnt/β-catenin signaling pathway;cell proliferation;posterior capsular opacification

R285.5

A

1672-1519（2016）12-0745-05

2016-08-26）

（本文編輯：馬 英，于春泉）

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.12.11

國家自然科學基金項目（81360145）。

包秀麗（1975-），女，醫學博士，主任醫師,主要從事白內障的臨床和基礎研究。